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上海宸功生物技術有限公司
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組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶動力比色法定量檢測試劑盒

時間:2017/1/18閱讀:1279
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組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶動力比色法定量檢測試劑盒

產品說明書

主要用途
組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性酶動力比色法定量檢測試劑是一種旨在通過特異反應系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)還原后峰值的增高,即采用比色法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品(動物、人體、植物、昆蟲、細菌等)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。
技術背景
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase;G6PD)是一種細胞漿中的酶,參與磷酸戊糖代謝通路,通過維持還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平,提供細胞還原性能量,進而保持谷胱甘肽水平,幫助細胞,例如紅細胞,防止氧化損傷。同時NADPH的產生,促進組織細胞(例如肝臟、脂肪組織、腎上腺等)生物合成脂肪酸、類異戊二烯等。在植物中,存在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的多種異構體,位于細胞漿、質體基質(plastidic stroma)、和過氧化體。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷將導致急性溶血性貧血,即蠶豆病?;谄咸烟?6-磷酸(D-glucose-6-phosphate)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用下,轉化為6-磷酸葡萄糖酸內脂(6-phosphoglucono-δ-lactone) 產物后,同時其輔酶因子氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(xoidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADP)轉化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADPH),通過測定吸光值的變化(340nm 波長),來定量分析葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反應系統(tǒng)為:
產品內容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
緩沖液(Reagent C) 毫升
反應液(Reagent D) 毫升
底色液(Reagent E) 毫升
陰性液(Reagent F) 毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存裂解液(Reagent B)、緩沖液(Reagent C)、反應液(Reagent D)和底色液(Reagent E)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;反應液(Reagent D)和底色液(Reagent E)避免光照;有效保證6月
用戶自備
1
1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
(微型)臺式離心機:用于樣品操作
比色皿或酶標板:用于比色的容器
分光光度儀或酶標板:用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液(Reagent B)置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、 樣品準備
1. 手術取出動物組織,并秤重500毫克組織重量
2. (選擇步驟)放進預冷的50毫升錐形離心管
3. (選擇步驟)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗
4. (選擇步驟)抽去清理液
5. 移入到一個液氮凍存管
6. 即刻放進液氮罐過夜
7. 次日從液氮罐里取出,即刻(zui快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融)
8. 放進一個15毫升錐形離心管
9. 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B)
10.強力渦旋震蕩30秒,充分混勻
11.放進冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒(注意:如需暫時停止,放進-70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫?br />12.即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g
13.小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
14.移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-)
15.放進-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測定準備
1. 開啟并設定好分光光度儀(溫度為25℃):波長340nm,間隔60秒,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零
2. 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;底色液(Reagent E)避免光照
三、 背景對照測定
1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升反應液(Reagent D)
3. 加入xx微升陰性液(Reagent F)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在25℃溫度下孵育2分鐘
6. (選擇步驟)放進分光光度儀,置零 2
7. (選擇步驟)取出比色皿
8. 加入xx微升底色液(Reagent E)
9. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內)
10.即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
四、 樣品測定
1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升反應液(Reagent D)
3. 加入5微升待測樣品(20微克蛋白)(注意:樣品須清澈)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在25℃溫度下孵育2分鐘
6. (選擇步驟)放進分光光度儀,置零
7. (選擇步驟)取出比色皿
8. 加入xx微升底色液(Reagent E)
9. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內)
10.即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù)(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
11.(選擇步驟)重復實驗步驟1至10,測讀新的樣品
五、計算樣品活性
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X (分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘
六、 酶標板測定
1. 在96孔酶標板上做好相應標記:背景對照和樣品
2. 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C)到96孔板中
3. 分別加入xx微升反應液(Reagent D)
4. 分別加入xx微升陰性液(Reagent F)或待測樣品(20微克蛋白)到相應孔中(注意:樣品須清澈)
5. 輕輕搖動96孔酶標板
6. 在25℃溫度下孵育2分鐘
7. 分別加入xx微升底色液(Reagent E)
8. 輕輕搖動酶標板
9. 即刻放進酶標儀檢測:5分鐘讀數(shù)和0分鐘讀數(shù)
10.活性計算
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X (分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘
3
注意事項
1. 本產品為50次操作,包括背景對照
2. 操作時,須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1次
4. 建議使用比色皿測定
5. 樣品須澄清,至關重要
6. 加樣后3秒內比色測定
7. 測定值由低到高變化;測定可持續(xù)5分鐘
8. 比色測定后,比色皿須清洗*
9. 樣本測定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
10.建議待測樣本蛋白濃度為20微克/5微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量(本公司提供 Bradford)
11.如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度
12.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶單位活性定義為:在25℃,pH 7.4條件下,每分鐘內能夠轉化1微摩爾葡萄糖糖-6-磷酸至6-磷酸葡萄糖酸內脂所需的酶量作為一個活性單位
13.本公司提供系列醫(yī)學生化經(jīng)典分析試劑產品
質量標準
1. 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產品經(jīng)鑒定檢測敏感
4
蛋白質濃度定量試劑盒

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