組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶動(dòng)力比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途
組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）活性酶動(dòng)力比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)特異反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）還原后峰值的增高，即采用比色法來(lái)測(cè)定組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌等）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PD）是一種細(xì)胞漿中的酶，參與磷酸戊糖代謝通路，通過(guò)維持還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平，提供細(xì)胞還原性能量，進(jìn)而保持谷胱甘肽水平，幫助細(xì)胞，例如紅細(xì)胞，防止氧化損傷。同時(shí)NADPH的產(chǎn)生，促進(jìn)組織細(xì)胞（例如肝臟、脂肪組織、腎上腺等）生物合成脂肪酸、類(lèi)異戊二烯等。在植物中，存在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的多種異構(gòu)體，位于細(xì)胞漿、質(zhì)體基質(zhì)（plastidic stroma）、和過(guò)氧化體。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷將導(dǎo)致急性溶血性貧血，即蠶豆病?；谄咸烟?6-磷酸（D-glucose-6-phosphate）在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用下，轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂（6-phosphoglucono-δ-lactone） 產(chǎn)物后，同時(shí)其輔酶因子氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（xoidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH），通過(guò)測(cè)定吸光值的變化（340nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
底色液（Reagent E） 毫升
陰性液（Reagent F） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
用戶(hù)自備
1
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)板：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
4． （選擇步驟）抽去清理液
5． 移入到一個(gè)液氮凍存管
6． 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
7． 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
8． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
10．強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11．放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br />12．即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
13．小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管
14．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－）
15．放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent E）避免光照
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升陰性液（Reagent F）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在25℃溫度下孵育2分鐘
6． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零 2
7． （選擇步驟）取出比色皿
8． 加入xx微升底色液（Reagent E）
9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）
四、 樣品測(cè)定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入5微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在25℃溫度下孵育2分鐘
6． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零
7． （選擇步驟）取出比色皿
8． 加入xx微升底色液（Reagent E）
9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）
11．（選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至10，測(cè)讀新的樣品
五、計(jì)算樣品活性
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X （分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘
六、 酶標(biāo)板測(cè)定
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
3． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
5． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
6． 在25℃溫度下孵育2分鐘
7． 分別加入xx微升底色液（Reagent E）
8． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：5分鐘讀數(shù)和0分鐘讀數(shù)
10．活性計(jì)算
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X （分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘
3
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為50次操作，包括背景對(duì)照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
4． 建議使用比色皿測(cè)定
5． 樣品須澄清，至關(guān)重要
6． 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
7． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
8． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
9． 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
10．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/5微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供 Bradford）
11．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
12．葡萄糖-6-磷酸脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾葡萄糖糖-6-磷酸至6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂所需的酶量作為一個(gè)活性單位
13．本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化經(jīng)典分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
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蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒