酵母雙雜交系統(tǒng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

酵母雙雜交系統(tǒng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化試劑是一種旨在通過(guò)化學(xué)處理和物理熱休克技術(shù)，快速制備酵母感受態(tài)細(xì)胞和同步轉(zhuǎn)化兩種特定構(gòu)建的目標(biāo)質(zhì)粒DNA的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種實(shí)驗(yàn)用酵母菌株和酵母質(zhì)粒。應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)和其它蛋白篩選檢測(cè)等。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效率平均高達(dá)105轉(zhuǎn)化細(xì)胞/微克DNA。

技術(shù)背景

酵母菌是一種低等單細(xì)胞真核生物，具有細(xì)胞生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡(jiǎn)單明了等原核生物的特點(diǎn)。作為模式生物，它具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，在分子遺傳學(xué)方面認(rèn)識(shí)zui早，zui先作為外源基因表達(dá)的細(xì)胞宿主。它是一種哺乳動(dòng)物基因調(diào)節(jié)的理想研究工具。其中酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid assay）是一種研究蛋白質(zhì)之間相互作用或遺傳篩選的實(shí)驗(yàn)工具，通過(guò)同步轉(zhuǎn)化兩種特定構(gòu)建的目標(biāo)載體（表達(dá)載體）包括結(jié)合載體—即“餌”載體（bait plasmid），和激活載體—即“捕”載體（hunter plasmid）或報(bào)告載體或基因分子庫(kù)載體，到同一感受態(tài)酵母細(xì)胞，通過(guò)氨基酸缺陷型培養(yǎng)基的選擇性培養(yǎng)和報(bào)告基因的檢測(cè)，來(lái)分析不同蛋白之間的相互作用和功能。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存強(qiáng)化液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

質(zhì)粒：用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)DNA片段

15毫升錐形離心管：用于酵母細(xì)胞收集的容器

臺(tái)式離心機(jī)：用于酵母細(xì)胞沉淀

渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

搖床：用于酵母細(xì)胞孵育

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

瓊脂平板：用于轉(zhuǎn)化后酵母細(xì)胞篩選

實(shí)驗(yàn)步驟

1． 準(zhǔn)備好10毫升過(guò)夜生長(zhǎng)的新鮮酵母細(xì)胞，例如AH109菌株（OD600＝1至2；1 X 107細(xì)胞/毫升）

2． 移入到15毫升錐形離心管

3． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3500g

4． 小心抽掉上清液

5． 加xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群

6． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3500g

7． 小心抽掉上清液

8． 加入xx毫升感化液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群

9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3500g

10．小心抽掉上清液

11．加入xx毫升感化液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群

12．放進(jìn)30℃搖床孵育60分鐘，速度為100RPM

13．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3500g

14．小心抽掉上清液

15．加入xx毫升感化液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群

16．移取300微升到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管，其余的保存在4℃冰箱里備用

17．加入xx微升強(qiáng)化液（Reagent D）

18．加入10微升用戶自備的“餌”載體DNA（總量為5微克）

19．加入10微升用戶自備的“捕”載體或基因分子庫(kù)載體DNA（總量為2.5微克）

20．渦旋震蕩15秒

21．加入xx毫升轉(zhuǎn)化液（Reagent C）

22．渦旋震蕩15秒

23．放進(jìn)30℃搖床孵育45分鐘，速度為100RPM

24．放進(jìn)42℃恒溫水槽孵育20分鐘，期間每隔5分鐘，輕度渦旋震蕩5秒

25．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3500g

26．小心抽掉上清液

27．加入xx毫升培養(yǎng)液（Reagent E），混勻

28．（選擇步驟）放進(jìn)30℃恒溫?fù)u床孵育1小時(shí)，速度為220RPM

29．分別移取50微升均勻鋪板在選擇性培養(yǎng)基的瓊脂平板上（注意：用戶可以適量稀釋后鋪板）

30．室溫下靜置30分鐘

31．倒置瓊脂平板

32．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱孵育2至8天，直至菌落出現(xiàn)

33．（選擇步驟）計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化細(xì)胞/微克DNA）

【菌落數(shù)X 5（毫升；轉(zhuǎn)化菌液總量）】÷【0.05（毫升；菌液鋪板容量）X 稀釋倍數(shù) X 5（微克；DNA量）】

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次（10毫升菌液）操作

2． 操作時(shí)須戴手套

3． 確保起始酵母菌量

4． 使用感化液（Reagent B）處理過(guò)的酵母細(xì)胞可以保存在4ºC冰箱2周

5． 如果轉(zhuǎn)化不同規(guī)格的酵母，可按比例調(diào)整使用試劑用量

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6． 本產(chǎn)品適用于各種酵母菌株的轉(zhuǎn)化，注意選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基；建議使用本公司系列酵母培養(yǎng)基

7． 建議使用高質(zhì)純化的DNA用于轉(zhuǎn)化，確保轉(zhuǎn)化效率

8． 本產(chǎn)品轉(zhuǎn)化效率可達(dá)104－106細(xì)胞/微克DNA

9． 本公司提供系列酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化效率高