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細胞酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量檢測試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
細胞酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過酪氨酸酶反應系統(tǒng)中底物酪氨酸氧化
后,產(chǎn)生多巴色素,呈現(xiàn)吸光峰值的變化,即采用比色法來測定細胞裂解懸液樣品中酶活性的而經(jīng)典
的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種人體和動物細胞,尤其是黑色素細胞
和黑色素瘤細胞裂解懸液樣品中酪氨酸酶的活性檢測,以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作
簡捷,性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
酪氨酸酶(tyrosinase;EC1.14.18.1)是一種單酚單加氧酶(monophenol monooxygenase),又稱為單酚酶
(monophenolase)或單酚二羥基苯丙氨酸:O2 氧化還原酶(monophenol dihydroxyphenylalanin:O2
oxidoreductase),具有雙功能的含銅糖蛋白,廣泛存在于植物、酵母和動物組織中,其蛋白結(jié)構(gòu)、大小、
糖基化方式、激活特征等都不同。人體酪氨酸酶是一個跨膜蛋白,而催化結(jié)構(gòu)域在黑色素細胞(melanocyte)
或色素細胞的黑色素器(melanosome)里。酪氨酸酶通過催化L-酪氨酸(L-tyrosine)等的o-羥基化
(o-hydroxylation)反應變成L-多巴(L-dopamine),進而氧化產(chǎn)生黑色素底物多巴醌(dopaquinone),
從而由多巴色素(dopachrome)轉(zhuǎn)化為黑色素(melanin)中的真黑素(eumelanin),以及其它色素,包括
毛發(fā)和眼睛色素。紫外線可以激活酪氨酸酶活性,嚴重時,會引起色素沉著(hyperpigmentation)。酪氨酸
酶基因突變將導致I 型眼皮膚白化?。╫culocutaneous albinism)。酪氨酸酶抑制劑成為增白化妝品的重要
元素。基于底物酪氨酸,在酪氨酸酶的催化下,產(chǎn)生多巴色素,通過其吸光值的變化(475nm 波長),來定
量測定酪氨酸酶的活性。其反應系統(tǒng)為:
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
緩沖液(Reagent C) 毫升
底物液(Reagent D) 毫升
陰性液(Reagent E) 微升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存裂解液(Reagent B)和底物液(Reagent D)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里;底物液(Reagent
D)避免光照,有效保證6 月
2
用戶自備
1.5 毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒:用于細胞脫離
微型臺式離心機:用于樣品制備
比色皿或酶標板:用于比色的容器
分光光度儀或酶標儀:用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。底物液(Reagent D)避免光照。然后進
行下列操作。
一、樣品準備
1. 準備好25cm2 細胞培養(yǎng)瓶或60mm 細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞(1 至5 X 106 細胞)
2. 小心加入xx 毫升清理液(Reagent A),覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入xx 毫升清理液(Reagent A),混勻細胞
6. 移入到預冷的15 毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始)
7. 放進4℃臺式離心機離心5 分鐘,速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液(Reagent B),充分混勻
10.轉(zhuǎn)移到預冷的1.5 毫升離心管
11.強力渦旋震蕩15 秒
12.置于冰槽里孵育30 分鐘
13.放進4℃微型臺式離心機離心5 分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14.小心移取500 微升上清液到新的預冷的1.5 毫升離心管
15.移取10 微升進行蛋白定量檢測
16.即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準備
1. 準備好上述待測樣品,置于冰槽里
2. 設(shè)定好分光光度儀(溫度為25℃):波長475nm
3. 緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
三、背景對照測定
1. 移取xx 微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx 微升底物液(Reagent D)
3. 充入氧氣2 分鐘
4. 加入xx 微升陰性液(Reagent E)
3
5. 上下傾倒數(shù)次,混勻
6. 室溫下(25℃)孵育60 分鐘
7. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景讀數(shù)
四、樣品測定
1. 移取xx 微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx 微升底物液(Reagent D)
3. 充入氧氣2 分鐘
4. 加入50 微升待測樣品(注意:50 微克蛋白總量)
5. 上下傾倒數(shù)次,混勻
6. 室溫下(25℃)孵育60 分鐘
7. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù)
五、計算樣品活性
六、酶標板測定
1. 在96 孔酶標板上做好相應標記:背景對照和樣品
2. 分別移取xx 微升緩沖液(Reagent C)到所有孔中
3. 分別加入xx 微升底物液(Reagent D)
4. 充入氧氣2 分鐘
5. 分別加入xx 微升陰性液(Reagent E)或待測樣品(50 微克蛋白總量)
6. 輕輕搖動酶標板
7. 室溫下(25℃)孵育60 分鐘
8. 即刻放進酶標儀檢測,獲得背景和樣品讀數(shù)
9. 活性計算
注意事項
1. 本產(chǎn)品為20 次(比色皿)和80 次(酶標板)操作,包括背景對照
2. 操作時,須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1 次
4. 測定值由低到高變化;測定持續(xù)60 分鐘
5. 比色測定后,比色皿須清洗*
6. 樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
7. 建議待測樣本蛋白濃度為50 微克/50 微升;如果樣本酶活性過低或過高, 則可以增加或降低樣本量
8. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
9. 可以使用酪氨酸酶抑制劑曲酸(Kojic acid)作為抑制劑對照或陰性對照
10.酪氨酸酶單位活性定義為:在25℃,pH 6.8 條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化產(chǎn)生1 微摩爾多巴色素所需的
4
酶量作為一個活性單位
11.本公司提供系列酪氨酸酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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