冰凍切片基質(zhì)金屬蛋白酶-2原位明膠酶譜法熒光染色試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

冰凍切片基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）原位明膠酶譜法（in situ zymography）熒光染色試劑是一種旨在通過異硫氰酸熒光素標(biāo)記的明膠作為底物，在特定抑制劑存在的情況下，針對未固定處理的冰凍切片予以染色處理，基質(zhì)金屬蛋白酶-2切離底物產(chǎn)生高度綠色熒光，來定位組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶-2活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種冰凍動物組織的基質(zhì)金屬蛋白酶-2的分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，熒光清晰，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲備MMPs，當(dāng)需要MMPs的信號傳遞到細(xì)胞后才臨時合成，合成的MMPs以無活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細(xì)胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應(yīng)。基質(zhì)金屬蛋白酶-2，又稱明膠酶A （gelatinase-A）或IV型膠原酶（type IV collagenase），其前體分子量為72kDa，激活后分子量為62和56 kDa。它在血清或細(xì)胞上清中濃度通常為10至200納克/毫升。它的作用目標(biāo)是天然和變性膠原蛋白（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連蛋白-5 （laminin-5）、前體腫瘤壞死因子-α（pro-TNF-α）和神經(jīng)（蛋白）聚糖（neurocan）。基質(zhì)金屬蛋白酶-2與腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移、血管形成、動脈粥樣硬化等疾病有關(guān)。原位明膠酶譜法熒光染色（in-situ fluorescence zymography）技術(shù)在于提高基質(zhì)金屬蛋白酶檢測的敏感性，使用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的明膠作為底物，在基質(zhì)金屬蛋白酶-9特異性抑制劑MERCK44478存在的情況下，經(jīng)過基質(zhì)金屬蛋白酶-2水解后產(chǎn)生熒光多肽，據(jù)此在熒光顯微鏡下檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2的活性和位置。

產(chǎn)品內(nèi)容

膠體液（Reagent A） 毫升

底物液（Reagent B） 微升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent B），嚴(yán)格避免光照，有效保證6月

用戶自備

復(fù)染液：用于樣品復(fù)染

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制的容器

蓋玻片：用于樣品孵育處理

微波爐：用于融化試劑

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于試劑溫育或孵育反應(yīng)物

熒光顯微鏡：用于樣品染色后觀察

實驗步驟

實驗開始前，準(zhǔn)備好10張10微米厚的冰凍切片。同時室溫下融化預(yù)熱染色液（Reagent B），避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

• 將膠體液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出或干枯）
• 小心移取xx微升膠體液（Reagent A）到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育10分鐘
• 同時瞬間37℃預(yù)熱染色液（Reagent B）
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的染色液（Reagent B），混勻
• （選擇步驟）加入1微升用戶自備的復(fù)染液
• 即刻分別加上40微升上述液體到未固定的冰凍切片的樣品上
• 蓋上蓋玻片（注意：避免氣泡）
• 放進(jìn)4℃冰箱里孵育10分鐘，或直至膠體凝結(jié)，避免光照
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照
• 即刻在熒光顯微鏡下觀察：激發(fā)波長480nm，散發(fā)波長530nm――綠色熒光增強(qiáng)，表明基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性高

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作 
• 操作時，須戴手套
• 樣品準(zhǔn)備要點如下：
  • 冰凍切片須在8至10微米厚，且未予固定處理
  • 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鰲和劑以及巰基乙醇和DTT等
  • 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）
  • 如果驗證樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶，可以使用EDTA或抑制劑預(yù)處理1小時作為對照
• 建議膠體液（Reagent A）瞬時加熱，以防干枯；或采用60℃度恒溫水槽加熱融化
• 建議使用10微克/毫升碘化丙啶（Propidium Iodide），作為復(fù)染染料
• 如果樣品活性過低，可以增加孵育時間至24小時
• 注意區(qū)分樣品的自發(fā)熒光
• 染色參考圖像如下：綠色熒光為基質(zhì)金屬蛋白酶-2；紅色熒光為碘化丙啶復(fù)染

• 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶酶譜檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰