細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書
主要用途
細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)捕獲劑二甲基亞砜，受到羥自由基的氧
化，進(jìn)而與偶氮染料反應(yīng)，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，由分光光度儀比色分析未反應(yīng)棕色成分，來(lái)定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)羥
自由基活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于
各種細(xì)胞（動(dòng)物、人體等）裂解懸液或培養(yǎng)上清的羥自由基檢測(cè)，以及羥自由基激發(fā)劑和抗氧化清除劑
（scanvenger）等的檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，
即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等
細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。其中羥自由基
或氫氧基具有極度反應(yīng)性和毒性，同時(shí)半衰期短（10－9至10－10秒）。其產(chǎn)生主要是水分子受到高能量放射后
裂解、過(guò)氧化物和次氯酸反應(yīng)、過(guò)氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亞砜（dimethy
sulfoxide；DMSO），作為羥自由基的分子探針，捕獲羥自由基，并被氧化為甲基亞磺酸（methane sulfinic acid；
MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物偶氮亞砜（diazosulfone），通過(guò)分光光度儀
（325nm波長(zhǎng)），檢測(cè)未反應(yīng)棕色成分，以測(cè)定羥自由基的含量。據(jù)此證明細(xì)胞內(nèi)活性氧族的存在。其反應(yīng)
系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
標(biāo)記液（Reagent B） 微升
酸性液（Reagent C） 微升
染色液（Reagent D） 瓶
終止液（Reagent E） 毫升
萃取液（Reagent F） 毫升
標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書1 份
保存方式
2
保存染色液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；
酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發(fā)，
注意密閉；染色液（Reagent D）避免光照；有效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)液配制的容器
2 毫升離心管：用于樣品操作的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離
DOUNCE 勻漿器：用于細(xì)胞裂解
臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備和反應(yīng)處理
石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器
分光光度儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品準(zhǔn)備
選擇一：培養(yǎng)細(xì)胞
1． 準(zhǔn)備好25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至5 X 106 細(xì)胞）
2． 小心抽去培養(yǎng)液
3． 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
4． 小心抽去清理液
5． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
6． 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
7． 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
8． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g
9． 小心抽去上清液
10．加入xx 毫升清理液（Reagent A）
11．強(qiáng)力渦旋震蕩15 秒
12．即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
13．在冰槽里用研磨棒勻化細(xì)胞（約80 下）
14．將所有細(xì)胞勻漿物移入15 毫升錐形離心管
15．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為10000g
16．小心移取3 毫升上清液到新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
17．移取10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
18．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
選擇二：細(xì)胞培養(yǎng)液
1． 移取3 毫升細(xì)胞培養(yǎng)液到15 毫升錐形離心管
2． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為10000g
3． 小心移取3 毫升上清液到新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
4． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
3
二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
1． 準(zhǔn)備好5 個(gè)1.5 毫升離心管，標(biāo)記為1 至5 號(hào)管
2． 分別加入xx 微升清理液（Reagent A）到2 至5 號(hào)管
3． 移取xx 微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到1 號(hào)管
4． 小心移取xx 微升1 號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到2 號(hào)管，混勻
5． 小心移取xx 微升2 號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到3 號(hào)管，混勻
6． 小心移取xx 微升3 號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到4 號(hào)管，混勻
7． 將1 至5 號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
管號(hào)清理液（Reagent A） 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G） 測(cè)定體系標(biāo)準(zhǔn)MSA 濃度
1 － xx 微升xx 微摩爾/升
2 xx 微升xx 微升1 號(hào)管xx 微摩爾/升
3 xx 微升xx 微升2 號(hào)管xx 微摩爾/升
4 xx 微升xx 微升3 號(hào)管xx 微摩爾/升
5 xx 微升0 0
三、標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent D）置入室溫下，然后移出xx 毫升清理液
（Reagent A）到染色液（Reagent D）瓶里，混勻后，標(biāo)記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰
槽里備用（注意：可以使用12 次）。放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作
1． 移取xx 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到2 毫升離心管
2． 加入xx 微升酸性液（Reagent C）
3． 加入xx 微升染色工作液，手動(dòng)混勻
4． 室溫下孵育10 分鐘，避免光照
5． 加入xx 微升終止液（Reagent E），手動(dòng)混勻
6． 加入xx 毫升萃取液（Reagent F），手動(dòng)混勻
7． 小心移取1 毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
8． 即刻（3 分鐘內(nèi)）放進(jìn)分光光度儀（325nm 波長(zhǎng)）檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
9． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1 至8 四次
10．構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)MSA 濃度（微摩爾/升）
四、樣品測(cè)定
1． 移取200 微升待測(cè)樣品到2 毫升離心管
2． 加入xx 微升標(biāo)記液（Reagent B）
3． 渦旋震蕩5 秒
4． 室溫下孵育30 分鐘
5． 加入xx 微升酸性液（Reagent C）
6． 加入xx 微升染色工作液，手動(dòng)混勻
7． 室溫下孵育10 分鐘，避免光照
8． 加入xx 微升終止液（Reagent E），手動(dòng)混勻
4
9． 加入xx 毫升萃取液（Reagent F），手動(dòng)混勻
10．小心移取1 毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
11．即刻（3 分鐘內(nèi)）放進(jìn)分光光度儀（325nm 波長(zhǎng)）檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
12．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)MSA 濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
13．計(jì)算樣品實(shí)際MSA 濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
14．或構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)活性氧生成曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為羥自由基活性氧吸光值（OD）；橫坐標(biāo)（X 軸）為
組織量、蛋白量、時(shí)間點(diǎn)或藥物處理濃度等
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
4． 終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發(fā)，注意密閉
5． 建議染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用為佳
6． 孵育時(shí)，必須避免光照
7． 建議使用新鮮樣品
8． 建議使用石英或玻璃比色皿
9． 本產(chǎn)品適合抗氧化能力檢測(cè)
10．用戶可以使用320 至360nm 之間的任一波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)
11．如果讀數(shù)大于1.5，可以使用萃取液（Reagent F）予以稀釋，但注意計(jì)算公式的稀釋倍數(shù)變化
12．本公司提供系列氧化應(yīng)急活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感