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細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧單線態(tài)氧氣比色法定量檢測試劑盒

時間:2017/1/18閱讀:1708
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細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧單線態(tài)氧氣比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書
主要用途
細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧單線態(tài)氧氣比色法定量檢測試劑是一種旨在通過二甲基-4-亞硝基苯胺,受到單線態(tài)
氧氣-的作用,出現(xiàn)去色現(xiàn)象,由分光光度儀比色分析,定量檢測細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧氣活性氧族的生成和增加
的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的??梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號傳遞、衰
老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,檢測敏感。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子(superoxide radical;O2-)、過氧化氫(hydrogen peroxide;H2O2)、羥自由基或氫氧基
(hydroxyl radical;OH-)、過氧化基(peroxyl radical;ROO-)、氫過氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧
自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric Oxide;NO-)、過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion;ONOO-)
次氯酸(hypochlorous acid;HClO)、半醌自由基(semiquinone radical)、單線態(tài)氧氣(singlet oxygen)等
細(xì)胞內(nèi)活性氧族(Reactive Oxygen Species;ROS)的產(chǎn)生和增多,將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。其中單線態(tài)氧
氣(singlet oxygen;1 O2)是分子氧(O2)的抗磁形式或電激發(fā)形式。通過染料分子,例如孟加拉紅(Rose
Bengal)、亞甲基蘭(Methylene Blue)、卟啉類化合物(Porphyrins)染料的光敏過程中能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生,或過
氧化氫和次氯酸的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生。單線態(tài)氧氣可以調(diào)節(jié)紫外線A輻射的生物學(xué)作用、激活各種細(xì)胞信號通
路等。單線態(tài)氧氣會導(dǎo)致植物的光動力損傷(photodynamic damage)和動物心血管問題。基于二甲基-4-亞
硝基苯胺(N,N-Dimethyl-p-nitrosoaniline;PNDA或RNO)作為單線態(tài)氧氣的選擇性受體,在單線態(tài)氧氣的
存在下,產(chǎn)生去色作用,在分光光度儀下(440nm波長),呈現(xiàn)吸光峰值的降低。據(jù)此定量檢測細(xì)胞內(nèi)單線
態(tài)氧氣活性氧族的濃度。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
緩沖液(Reagent C) 毫升
反應(yīng)液(Reagent D) 毫升
陰性液(Reagent E) 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里;反應(yīng)液(Reagent D)避免光照;有
效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
細(xì)胞刮脫棒:用于細(xì)胞脫離
(微型)臺式離心機:用于樣品操作
2
培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)孵育
比色皿或酶標(biāo)板:用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于比色分析
實驗步驟
一、樣品準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞(1 至5 X 106 細(xì)胞)
2. 小心加入xx 毫升清理液(Reagent A),覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:避免使用胰酶消化)
5. 加入xx 毫升清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
6. 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開始)
7. 放進4℃臺式離心機離心5 分鐘,速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液(Reagent B),充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
1. 強力渦旋震蕩15 秒
11. 置于冰槽里孵育30 分鐘
12. 放進4℃微型臺式離心機離心15 分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
13. 小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管
14. 移取10 微升進行蛋白定量檢測
15. 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準(zhǔn)備
1. 開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為30℃):波長440nm,并置零
2. 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;反應(yīng)液(Reagent D)避免光照
三、背景對照測定
1. 移取xx 微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx 微升陰性液(Reagent E)
3. 加入xx 微升反應(yīng)液(Reagent D)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在30℃溫度下孵育40 分鐘
6. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照
四、樣品測定
1. 移取xx 微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
3
2. 加入100 微升待測樣品(50 微克蛋白)(注意:樣品須清澈)
3. 加入xx 微升反應(yīng)液(Reagent D)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在30℃溫度下孵育40 分鐘
6. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù)
五、計算樣品濃度
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 1 (體系容量;毫升)X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1(樣品容量;毫升)X 34.4(毫摩
爾吸光系數(shù))]=微摩爾1 O2/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=微摩爾1 O2/毫克
六、酶標(biāo)板測定
1. 在96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對照和樣品
2. 分別移取xx 微升緩沖液(Reagent C)到96 孔板的所有孔中
3. 分別加入xx 微升陰性液(Reagent E)或待測樣品(20 微克蛋白)到相應(yīng)孔中(注意:樣品須清澈)
4. 分別加入xx 微升反應(yīng)液(Reagent D)到96 孔板的所有孔中
5. 輕輕搖動96 孔酶標(biāo)板
6. 在30℃溫度下孵育40 分鐘
7. 即刻放進酶標(biāo)儀檢測:獲得吸光讀數(shù)
8. 濃度計算:
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 0.25 (體系容量;毫升)X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.025(樣品容量;毫升)X 34.4
(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(厘米)]=微摩爾1 O2/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=微摩爾1 O2/毫克
注意事項
1. 本產(chǎn)品為20 次(比色皿)或80 次(酶標(biāo)板)操作
2. 避免使用*處理樣品
3. 操作時,須戴手套
4. 孵育時,避免光照
5. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1 次
6. 建議使用比色皿測定
7. 樣品須澄清,至關(guān)重要
8. 測定值由高到低變化
9. 比色測定后,比色皿須清洗*
10.建議待測樣本蛋白濃度為50 微克/100 微升;如果樣本濃度過低或過高, 則可以增加或降低樣本量
11.如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
12.可以使用單線態(tài)氧氣抑制劑或清除劑(scavenger),即NaN3 和DABCO 作為抑制劑對照或陰性對照
13.可以使用單線態(tài)氧氣激發(fā)劑(generator),即萘啶酮酸(Nalidixic acid)等作為陽性對照
14.本公司提供系列活性氧檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
4
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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