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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒

時(shí)間:2017/1/18閱讀:1355
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胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM,與鈣離子結(jié)合后,其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),在熒光分光光度儀下測(cè)量不同激發(fā)波長(zhǎng)下相對(duì)熒光峰值的比值,來測(cè)定細(xì)胞漿總鈣離子濃度而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞(動(dòng)物、人體等)或冰凍切片組織細(xì)胞漿鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì),占1150克。其中99%的鈣以氟磷灰石(calcium fluorophosphate apatite)形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式:一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣,其構(gòu)成約40%至50%的血清中的總鈣含量;另一種為彌散型游離鈣,其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣(complexed calcium)和離子鈣(ionized calcium)。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性neuromuscular excitability)、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi),鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中細(xì)胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細(xì)胞漿鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法flame photometry)、原子吸收分光光度法等技術(shù),但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾,或者受限于儀器的特殊的要求,以及需要線粒體、細(xì)胞漿分離。Fura-2 AM(acetoxy-methyl ester),一種具有細(xì)胞膜通透性,與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料,通過其不同激發(fā)波長(zhǎng)340nm/380nm產(chǎn)生的熒光信號(hào)比(散發(fā)波長(zhǎng)510nm)來測(cè)定細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子水平。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A)      毫升

染色液(Reagent B)  微升

介導(dǎo)液(Reagent C)      微升

飽和液(Reagent D)      毫升

陰性液(Reagent E)      毫升

裂解液(Reagent F)      微升

產(chǎn)品說明書  1份

 

保存方式

 

保存染色液(Reagent B)和介導(dǎo)液(Reagent C)在-20冰箱里,避免光照;其余的保存4冰箱里,有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于工作液配制的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱:用于染色孵育

96孔培養(yǎng)板:用于樣品操作的容器

熒光酶標(biāo)儀:用于熒光分析

(共聚焦)熒光顯微鏡:用于熒光染色觀察

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

  • 測(cè)定準(zhǔn)備

 

  • 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀:激發(fā)波長(zhǎng)340nm和380nm,散發(fā)波長(zhǎng)510nm
  • 測(cè)定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(Reagent B室溫下融化,然后分別移出  微升介導(dǎo)液(Reagent C  微升染色液(Reagent B到新的1.5毫升離心管,標(biāo)記為染色工作液,并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

 

二、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)

 

  • 準(zhǔn)備1個(gè)96細(xì)胞培養(yǎng)板,標(biāo)記為:細(xì)胞樣品孔、空白對(duì)照孔(不含細(xì)胞)、zui大對(duì)照孔(含細(xì)胞)
  • 小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液
  • 加入  微升清理液(Reagent A)到細(xì)胞樣品孔里
  • 加入  微升飽和液(Reagent D到zui大對(duì)照孔里
  • 加入  微升陰性液(Reagent E到空白對(duì)照孔
  • 分別加入  微升染色工作到所有孔里
  • 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板,混勻
  • 放進(jìn)37細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心抽去細(xì)胞樣品孔里的上清液
  • 小心加入  微升清理液(Reagent A)細(xì)胞樣品孔
  • 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11和12一次
  • 放進(jìn)37細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 加入  微升裂解液(Reagent F)zui大對(duì)照孔
  • 放進(jìn)37細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘
  • 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀:獲得相對(duì)熒光單位(relative fluorescence unit;RFU)包括樣品RFU340nm、樣品RFU380nm、空白對(duì)照孔R(shí)FU340nm、空白對(duì)照孔R(shí)FU380nm、zui大對(duì)照孔R(shí)FU340nm、zui大對(duì)照孔R(shí)FU380nm
  • 計(jì)算樣品細(xì)胞漿鈣離子濃度 

 

 

 

三、(共聚焦)或熒光顯微鏡檢測(cè)

 

1. 準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的細(xì)胞爬片樣品

  • 小心加上  微升清理液(Reagent A),覆蓋樣品表面
  • 小心移去樣品上的清理液(Reagent A)
  • 移取  微升清理液(Reagent A)到新的1.5毫升離心管
  • 加入  微升染色工作液,混勻 
  • 小心加上上述含有染色工作液的溶液到樣品上,覆蓋樣品表面
  • 放進(jìn)37細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心移去樣品上的染色工作液
  • 小心加上  微升新鮮的清理液(Reagent A)
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 小心加上  微升新鮮的清理液(Reagent A)
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 蓋上蓋玻片
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)340至400nm,散發(fā)波長(zhǎng)510nm(細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍(lán)熒光

 

四、冰凍切片檢測(cè)

 

  • 準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的冰凍切片
  • 小心加上  微升清理液(Reagent A),覆蓋切片樣品表面
  • 小心移去樣品上的清理液(Reagent A)
  • 移取  微升清理液(Reagent A)到新的1.5毫升離心管
  • 加入  微升染色工作液,混勻 
  • 小心加上上述含有染色工作液的溶液切片樣品上,覆蓋樣品表面
  • 放進(jìn)37細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘,避免光照
  • 小心移去切片上的染色工作液
  • 小心加上  微升新鮮的清理液(Reagent A)
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 小心加上  微升新鮮的清理液(Reagent A)
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 小心移去清理液(Reagent A)
  • 蓋上蓋玻片
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)340至400nm,散發(fā)波長(zhǎng)510nm(組織細(xì)胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍(lán)熒光

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20(顯微鏡)或60次(酶標(biāo)板)操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 可以使用熒光分光光度儀檢測(cè)
  • 如果細(xì)胞內(nèi)酯酶缺失,則建議使用微注射(microinjection)技術(shù)
  • 避免使用EDTA等處理樣品
  • 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
  • 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 檢測(cè)敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍
  • 本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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