胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強度顯著增強，在熒光分光光度儀下測量不同激發(fā)波長下相對熒光峰值的比值，來測定細胞漿總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞（動物、人體等）或冰凍切片組織細胞漿鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細胞內(nèi)，鈣離子主要儲存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器中。其中細胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道，維持細胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細胞漿鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要線粒體、細胞漿分離。Fura-2 AM（acetoxy-methyl ester），一種具有細胞膜通透性，與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料，通過其不同激發(fā)波長340nm/380nm產(chǎn)生的熒光信號比（散發(fā)波長510nm）來測定細胞漿內(nèi)鈣離子水平。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）     　毫升

染色液（Reagent B） 　微升

介導(dǎo)液（Reagent C）     　微升

飽和液（Reagent D）     　毫升

陰性液（Reagent E）     　毫升

裂解液（Reagent F）     　微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

96孔培養(yǎng)板：用于樣品操作的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實驗步驟

• 測定準備

• 設(shè)定好熒光酶標儀：激發(fā)波長340nm和380nm，散發(fā)波長510nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出　　微升介導(dǎo)液（Reagent C）和　　微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

二、熒光酶標儀檢測

• 準備1個96孔細胞培養(yǎng)板，標記為：細胞樣品孔、空白對照孔（不含細胞）、zui大對照孔（含細胞）
• 小心抽去細胞樣品孔的培養(yǎng)液
• 加入　　微升清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 加入　　微升飽和液（Reagent D）到zui大對照孔里
• 加入　　微升陰性液（Reagent E）到空白對照孔里
• 分別加入　　微升染色工作液到所有孔里
• 輕輕搖動酶標板，混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去細胞樣品孔里的上清液
• 小心加入　　微升清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 重復(fù)實驗步驟11和12一次
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 加入　　微升裂解液（Reagent F）到zui大對照孔里
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）包括樣品RFU340nm、樣品RFU380nm、空白對照孔RFU340nm、空白對照孔RFU380nm、zui大對照孔RFU340nm、zui大對照孔RFU380nm
• 計算樣品細胞漿鈣離子濃度 

三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測

1． 準備1個待測的細胞爬片樣品

• 小心加上　　微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取　　微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入　　微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述含有染色工作液的溶液到樣品上，覆蓋樣品表面
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去樣品上的染色工作液
• 小心加上　　微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上　　微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長340至400nm，散發(fā)波長510nm（細胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍色熒光）

四、冰凍切片檢測

• 準備1個待測的冰凍切片
• 小心加上　　微升清理液（Reagent A），覆蓋切片樣品表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取　　微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入　　微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述含有染色工作液的溶液到切片樣品上，覆蓋樣品表面
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去切片上的染色工作液
• 小心加上　　微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上　　微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長340至400nm，散發(fā)波長510nm（組織細胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍色熒光）

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（顯微鏡）或60次（酶標板）操作
• 操作時，須戴手套
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 如果細胞內(nèi)酯酶缺失，則建議使用微注射（microinjection）技術(shù)
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感