細(xì)胞內(nèi)核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）比色法測定試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途
細(xì)胞內(nèi)核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）比色法測定試劑是一種旨在使用單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗
體以及辣根過氧化物酶綴合物二抗，通過染料四甲基聯(lián)苯胺染色顯示藍(lán)色，即通過比色法定量評價(jià)DNA
損傷水平的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種活體細(xì)胞（動(dòng)
物、人體等）的8-羥基脫氧鳥苷的定量分析。廣泛用于細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、腫瘤等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無
菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。
技術(shù)背景
核酸氧化損傷（nucleotide oxidative damage），包括DNA 和RNA 損傷，是由于環(huán)境因子或細(xì)胞代謝影響，
在逃避細(xì)胞防御機(jī)制的前提下，所產(chǎn)生的四種損傷之一：氧化、烷化（alkylation）、水解和堿基錯(cuò)配損傷等。
而氧化損傷主要通過活性氧族（reactive oxygen species；ROS），包括超氧自由基陰離子（superoxide radical；
O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl
radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；
NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）等的作用，使堿基羥基化和嘌呤環(huán)裂開，誘導(dǎo)鳥
嘌呤（guanine；G）向胸腺嘧啶（thymine；T）的顛換（transversion），造成體細(xì)胞基因突變，影響細(xì)胞周
期、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡等，zui終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，例如糖尿病、高血壓、中風(fēng)、癌癥、衰老等。其
中核酸損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine；8-OHdG）作為DNA 損傷的分子標(biāo)志；8-
羥基鳥苷（8-hydroxyguanosine）作為RNA 損傷的分子標(biāo)志。8-羥基脫氧鳥苷是zui常見的DNA 損傷產(chǎn)物，
也是氧化應(yīng)急的生物標(biāo)志。四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）是過氧化物酶（Peroxidase）
的生色底物，在過氧化物酶的催化下，電子供體TMB 底物在過氧化氫氧化下失去電子，產(chǎn)生游離自由陽
離子單電子氧化產(chǎn)物，在pH4.9 條件下，呈現(xiàn)出顏色變化和沉積，形成藍(lán)色沉淀產(chǎn)物，且不受乙醇影響。
被用于檢測標(biāo)記過氧化物酶的活性，靈敏度高，特異性好。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
固著液（Reagent B） 毫升
酶解液A（Reagent C） 毫升
酶解液B（Reagent D） 毫升
變性液（Reagent E） 毫升
中和液（Reagent F） 毫升
封阻液A（Reagent G） 毫升
封阻液B（Reagent H） 毫升
抗體液（Reagent I） 毫升
二抗液（Reagent J） 毫升
染色液（Reagent K） 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
2
保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)禁反復(fù)凍融；染色液（Reagent K）避免光照；有效保證6 月
用戶自備
96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于細(xì)胞培養(yǎng)的容器
培養(yǎng)箱：用于細(xì)胞染色孵育
酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：
1． 準(zhǔn)備1 個(gè)96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板
2． 接種待測細(xì)胞（2 X 104 細(xì)胞）
3． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
4． 加入xx 微升清理液（Reagent A），鋪滿培養(yǎng)表面
5． 小心抽去清理液（Reagent A）
6． 加入xx 微升－20℃預(yù)冷的固著液（Reagent B）
7． 置于－20℃冰箱里孵育20 分鐘
8． 小心抽去固著液（Reagent B）
9． 空氣中晾干
10．加入xx 微升清理液（Reagent A）
11．室溫下孵育2 分鐘
12．小心抽去清理液（Reagent A）
13．加入xx 微升酶解液A（Reagent C）
14．置于37℃培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘
15．小心抽去酶解液A（Reagent C）
16．加入xx 微升清理液（Reagent A）
17．室溫下孵育2 分鐘
18．小心抽去清理液（Reagent A）
19．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟16 至18 一次
20．加入xx 微升酶解液B（Reagent D）
21．置于37℃培養(yǎng)箱里孵育10 分鐘
22．小心抽去酶解液B（Reagent D）
23．加入xx 微升清理液（Reagent A）
24．室溫下孵育2 分鐘
25．小心抽去清理液（Reagent A）
26．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟23 至25 一次
27．加入xx 微升變性液（Reagent E）
28．室溫下孵育10 分鐘
29．小心抽去變性液（Reagent E）
30．加入xx 微升中和液（Reagent F）
31．室溫下孵育5 分鐘
32．小心抽去中和液（Reagent F）
3
33．加入xx 微升清理液（Reagent A）
34．室溫下孵育2 分鐘
35．小心抽去清理液（Reagent A）
36．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟33 至35 一次
37．加入xx 微升封阻液A（Reagent G）
38．室溫下孵育30 分鐘
39．小心抽去封阻液A（Reagent G）
40．加入xx 微升清理液（Reagent A）
41．室溫下孵育2 分鐘
42．小心抽去清理液（Reagent A）
43．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟40 至42 一次
44．加入xx 微升封阻液B（Reagent H）
45．室溫下孵育30 分鐘
46．小心抽去封阻液B（Reagent H）
47．加入xx 微升抗體液（Reagent I）
48．置于37℃培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘（或4 冰箱里孵育過夜）
49．小心抽去抗體液（Reagent I）
50．加入xx 微升清理液（Reagent A）
51．置于37℃培養(yǎng)箱里孵育2 分鐘
52．小心抽去清理液（Reagent A）
53．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步50 至52 二次
54．加入xx 微升二抗液（Reagent J）
55．置于37℃培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘，避免光照
56．小心抽去二抗液（Reagent J）
57．加入xx 微升清理液（Reagent A）
58．置于37℃培養(yǎng)箱里孵育2 分鐘
59．小心抽去清理液（Reagent A）
60．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步57 至59 二次
61．小心加入xx 微升的染色液（Reagent K）
62．室溫下孵育30 分鐘，避免光照（注意：可見藍(lán)色沉淀）
63．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀測讀：波長650nm
64．構(gòu)建細(xì)胞-DNA 損傷曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）吸光值（OD）為DNA 損傷程度；橫坐標(biāo)（X 軸）為細(xì)胞
數(shù)、時(shí)間點(diǎn)或藥物處理濃度等
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次操作量
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，須嚴(yán)格無菌，以防污染
4． 孵育時(shí)，須避免光照
5． 染色時(shí)間可以根據(jù)情況調(diào)整，以免造成過度染色或背景過深
6． 如果染色過快或過深，建議稀釋一抗和二抗?jié)舛?br />7． 如果用戶沒有650nm 的濾波器，可以使用630 至650 之間的任一波長
8． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行比色分析
4
9． 本公司提供系列DNA 損傷檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感