細(xì)菌銅型亞硝酸鹽還原酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

細(xì)菌銅型亞硝酸鹽還原酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)底物亞硝酸鹽，在鐵型抑制劑的存在下，被催化產(chǎn)生氨或一氧化氮的同時(shí)，人工電子供體還原型甲基紫精氧化后呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中銅型亞硝酸鹽還原酶特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解懸液樣品的銅型亞硝酸鹽還原酶的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase；NiR）是一類催化亞硝酸鹽為氨或一氧化氮的還原反應(yīng)的酶，其分成同化型（assimilatory）和異化型（dissimilatory）亞硝酸還原酶，在生物氮循環(huán)進(jìn)行厭氧能量代謝中起著重要作用。同化型酶以鐵氧還原蛋白、FAD、非血紅素鐵、西羅血紅素（siroheme）、NAD（P）H等為電子供體，進(jìn)行6個(gè)電子的還原產(chǎn)生氨（ammonification），包括高等植物、綠藻及藍(lán)藻、粗糙脈孢菌（Neur-ospora crassa）、和大腸埃希氏菌（Escherichia coli）等。異化型酶參與使用亞硝酸氧化有機(jī)物質(zhì)的過(guò)程，包括單電子反應(yīng)生成NO和6個(gè)電子的還原產(chǎn)生氨。其脫氮作用（denitrification）是細(xì)菌或真菌等獲得能量、適應(yīng)環(huán)境生存的生理過(guò)程。脫氮細(xì)菌、真菌或植物的亞硝酸還原酶有二種：銅型和鐵型。銅型（CuNiR）含有類似于銅藍(lán)蛋白（azurin）的銅中心部位，含有2個(gè)銅原子，銅藍(lán)蛋白為電子供體；鐵型（ccNiR）含有同源雙體，分別62Kd，包括c型和d1型細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞色素C為電子供體。銅型和鐵型的生理反應(yīng)相同，但同一細(xì)菌互不共有（mutual exclusive）。銅型（EC1.7.2.1），由基因nrfK編碼，主要在無(wú)色菌（achromobacter）、沼澤紅假單胞桿菌（rhodopseudomonas）、某種產(chǎn)堿桿菌（alcaligenes）等細(xì)菌周質(zhì)（periplasmic）中存在。基于底物亞硝酸鹽（KNO2），在鐵型抑制劑聯(lián)吡啶（dipyridil）和EDTA以及人工電子供體還原型甲基紫精（methyl viologen）的參與下，受到亞硝酸鹽還原酶的催化產(chǎn)生氨或一氧化氮，同時(shí)還原型甲基紫精轉(zhuǎn)化為氧化型甲基紫精，通過(guò)其吸收峰值的變化（600nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析銅型亞硝酸鹽還原酶的特異活性。其反應(yīng)方式為： 

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于制備樣品的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

酶標(biāo)板或比色皿：用于比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好500微升待測(cè)細(xì)菌（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 轉(zhuǎn)移到到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)讀準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里融化 
• 設(shè)定好分光光度儀：溫度37℃，波長(zhǎng)600nm，間隔1分鐘，測(cè)讀6次（共5分鐘），并置零或設(shè)置0分鐘和5分鐘各測(cè)讀1次
• 測(cè)定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的還原液（Reagent F）和稀釋液（Reagent G）置于冰槽里融化，然后移出xx微升稀釋液（Reagent G）到1管還原液（Reagent F），混勻后，置于冰槽里備用；用畢即刻放進(jìn)－70℃保存
• 測(cè)定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent E）置入冰槽里融化，然后移出40微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升上述新鮮配制的還原液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，放在暗室里備用
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入xx微升陰性液（Reagent H）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）：

• 樣品測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D)
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入10微升待測(cè)樣品（注意：建議總量50微克細(xì)菌總蛋白，且樣品需澄清）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）：

• （選擇步驟）樣品活性特異性測(cè)定（如果為銅型，則特異活性測(cè)定為零）

檢測(cè)開(kāi)始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent I）和待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)菌裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）

• 計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)板測(cè)定

（一）樣品活性測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測(cè)樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入xx微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 分別加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 分別加入10微升陰性液（Reagent H）或待測(cè)樣品（注意：建議總量50微克細(xì)菌總蛋白，且樣品需澄清）到相應(yīng)孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
• 計(jì)算樣品酶活性

• （選擇步驟）樣品活性特異性測(cè)定（如果為銅型，則特異活性測(cè)定為零）

檢測(cè)開(kāi)始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent I）和待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)菌裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品
• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 加入xx微升底物液（Reagent D）
• 加入xx微升含有反應(yīng)液（Reagent E）和還原液（Reagent F）的反應(yīng)工作液
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
• 計(jì)算樣品酶活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 如果需要誘導(dǎo)亞硝酸鹽還原酶的活性，*加入FAD或FAM；第二，密封培養(yǎng)瓶瓶蓋，充入氬氣（argon）培養(yǎng)過(guò)夜，確保厭氧狀態(tài)；第三，必要時(shí)加入硫酸銅
• 樣品中避免含有各種還原性化學(xué)物質(zhì)，包括巰基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol；DTT）、維生素C（ascorbic acid）和*（azide）等
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 加樣后3秒內(nèi)進(jìn)行比色測(cè)定
• 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以增加或減少甚至稀釋樣品量
• 建議待測(cè)樣本總蛋白濃度為50微克/10微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量
• 銅型亞硝酸鹽還原酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾亞硝酸鹽所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列亞硝酸鹽還原酶分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感