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通用型細(xì)菌鑒定16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒

時間:2017/1/18閱讀:1636
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通用型細(xì)菌鑒定16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書
主要用途
通用型細(xì)菌鑒定16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑是一種旨在根據(jù)保守性序列設(shè)計引物,針對微生物樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)一步測序后借助分析工具予以同源比較,由可變序列識別和分類微生物樣品的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的??梢员挥糜诟鞣N微生物的鑒定、歸類、建樹等系統(tǒng)微生物學(xué)的研究。產(chǎn)品即到即用,性能穩(wěn)定,操作簡便,擴(kuò)增效率顯著。
技術(shù)背景
16SrRNA作為非培養(yǎng)依賴性標(biāo)記的分子指模(fingerprinting)技術(shù),有別于傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)技術(shù),用于研究微生物的分類學(xué)(phylogenetics)。核糖體RNA(ribosome RNA)存在于所有微生物體內(nèi),且結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)化保留;容易分離和識別;其一級和二級結(jié)構(gòu)具有高度進(jìn)化保守區(qū)域(conserved region)和物種特異性可變區(qū)域(variable region);其基因序列變異非常緩慢,且不會發(fā)生平行基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer)。其包括5S、16S、23S。5S信息量不夠充分;23S不穩(wěn)定;而微生物16SrRNA基因較為穩(wěn)定,初級結(jié)構(gòu)含有1500個堿基。通過引物設(shè)計,擴(kuò)增產(chǎn)物測序,數(shù)據(jù)庫對照,鑒定微生物的類別或建立新的微生物在進(jìn)化樹上的位置。
產(chǎn)品內(nèi)容
擴(kuò)增液(Reagent A) 微升
引物液(Reagent B) 微升
補(bǔ)充液(Reagent C) 毫升
測序引物A(Reagent D) 微升
測序引物B(Reagent E) 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里;有效保證6月
用戶自備
PCR級礦物油:用于封隔反應(yīng)液
PCR儀:用于樣品擴(kuò)增
PCR管或平板:用于PCR反應(yīng)的容器
瓊脂糖凝膠電泳:用于擴(kuò)增后電泳分析
實驗步驟
實驗開始前,從-20℃冰箱中取出試劑,放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作: 
1. 針對一個樣本,每次移出 15 微升 擴(kuò)增液(Reagent A)到 PCR 管
2. 加入 1 微升用戶自備的的待測 DNA 樣品(總量 100 納克)
3. 微升 引物液(Reagent B)
4. 再加入 微升 補(bǔ)充液(Reagent C)(反應(yīng)總量為 25 微升)
5. 即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)瞬時離心 5秒,速度為500g(或2000RPM;例如 eppendorf 5415)
6. (選擇步驟)加入 50微升用戶自備的 PCR 級礦物油(注意:參見注意事項 13)
7. 即刻進(jìn)行熱啟動 PCR 反應(yīng):
溫度(℃)時間  循環(huán)
95       2分鐘   1
95       1分鐘   30
45       1分鐘   30
70       1分鐘   30
70       5分鐘    1
8. 反應(yīng)完畢后,移取5微升進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳:產(chǎn)物為1.5kb左右
9. 如果繼續(xù)測序鑒定,膠回收PCR產(chǎn)物(建議使用)
10.分別移出2微升用戶自備的測序反應(yīng)液到2個不同的新的1.5毫升離心管
11.加入1微升測序引物A(Reagent D)到其中一個1.5毫升離心管,作好標(biāo)記
12.加入1微升測序引物B(Reagent E)到另一個1.5毫升離心管,作好標(biāo)記
13.進(jìn)行后續(xù)的測序反應(yīng)
注意事項
1. 本產(chǎn)品為20次操作
2. 操作時,須戴手套
3. 建議使用帶濾芯的槍頭,避免污染
4. 在-20℃冰箱里儲存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
5. 建議樣品為純培養(yǎng)微生物的DNA;DNA提取應(yīng)確保高純度
6. 可以使用菌落直接檢測:用無菌槍頭點觸
7. 如果沒有擴(kuò)增條帶,可以直接測序,或詢問特殊引物設(shè)計服務(wù)
8. 可以直接使用純化的基因組DNA進(jìn)行測序
9. 可以將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,克隆到質(zhì)粒中,然后進(jìn)行測序
10.測序引物A(Reagent D)為上游引物,可以獲得500至1500的序列;引物序列為:
5-CAGCAGCCGCGGTAATAC3
11.測序引物B(Reagent E)為下游引物,可以獲得0至500的序列;引物序列為:
5-GTATTACCGCGGCTGCTG-3
12.測序建議優(yōu)先使用測序引物B(Reagent E),其可變區(qū)域較為特征
13.根據(jù)用戶PCR儀的性能,決定是否加入礦物油(Mineral Oil)
14.建議使用軟件測算Tm溫度;參考公式為Tm=4(G+C)+2(A+T)
15.本公司提供16SrDNA特異性引物設(shè)計服務(wù)
16.測序后,序列分析和微生物分類分析工具參考如下:
1)樣品序列與數(shù)據(jù)庫已知微生物序列的比對(BLAST) 2
高質(zhì)純化膠回收試劑盒
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2)樣品序列的分類學(xué)分析前的預(yù)編輯
http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/docs/biosoft-free.html
3)樣品的進(jìn)化樹的確立
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html
http://www.lms.si.edu/PAUP
4)16SrRNA 數(shù)據(jù)庫
http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de
17.本公司提供系列細(xì)菌 16S rDNA 擴(kuò)增檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
3. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確

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