人體hTERT基因甲基化檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

人體hTERT基因甲基化檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)化學(xué)方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經(jīng)過(guò)甲基化特異性PCR擴(kuò)增，探測(cè)到人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT啟動(dòng)子CpG島甲基化信息的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的?？梢员挥糜?/span>人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化保證。

技術(shù)背景

在基因的啟動(dòng)子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸“CG”的區(qū)域，稱為“CpG島”（CpG island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬(wàn)個(gè)CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是DNA甲基化的*位置。CpG島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human omerase reverse transcriptase；hTERT），又稱hTRT、hTCS1 和hEST2，是端粒酶的核心結(jié)構(gòu)，即催化亞體（catalytic subunit）。hTERT的功能性表達(dá)是端粒酶獲得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶，使細(xì)胞獲得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速?zèng)Q定成分，其mRNA表達(dá)水平與端粒酶活性之間具有密切的相關(guān)性。hTERT是一單拷貝基因，定位于5q15.33，屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族，具有進(jìn)化上的保守性，序列總長(zhǎng)約35kb，由16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子組成。端粒酶特異性T-motif和7個(gè)同源保守序列的RT-motif分別位于不同的外顯子上。hTERTmRNA 還有7種不同的剪切轉(zhuǎn)錄本，分為缺失型與插入型兩類。一旦突變或甲基化，會(huì)造成細(xì)胞繁殖調(diào)控機(jī)制缺失，而致腫瘤或細(xì)胞衰老等。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存 處理液（Reagent C）、 轉(zhuǎn)化液（Reagent D）、 助沉液（Reagent I）、 擴(kuò)增液（Reagent M）、 補(bǔ)充液（Reagent N）、  U引物F（Reagent O）、  U引物R（Reagent P）、  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里； 凈化液（Reagent F）和 針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里； 處理液（Reagent C）和 轉(zhuǎn)化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀樣品或去除雜質(zhì)

渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴(kuò)增

PCR管或平板：用于PCR反應(yīng)的容器

測(cè)序試劑盒：用于測(cè)序前的產(chǎn)物處理

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將 處理液（Reagent C）和 轉(zhuǎn)化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，置入室溫下。同時(shí)將其中一管 緩沖液（Reagent A）置入65℃恒溫水槽中預(yù)熱備用。然后進(jìn)行下列操作：

• 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

• 準(zhǔn)備1個(gè)2.0毫升離心管
• 加入2微克DNA樣品
• 加入適量的 緩沖液（Reagent A）到50微升反應(yīng)體系（注意：不要使用65℃預(yù)熱的 緩沖液（Reagent A））
• 加入xx微升 變性液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升 處理液（Reagent C）（注意：可見(jiàn)溶液呈現(xiàn)黃色）
• 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻
• 加入xx微升 轉(zhuǎn)化液（Reagent D），上下傾倒混勻
• 加入xx微升 封隔液（Reagent E）
• 放進(jìn)55℃恒溫水槽孵育16小時(shí)
• 小心抽去xx微升 封隔液（Reagent E）
• 加入xx毫升充分搖勻的 凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻（注意： 凈化液（Reagent F）出現(xiàn)沉淀，37℃溫育后使用）
• 移入到針筒離心柱
• 連接到真空泵，將柱內(nèi)液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 加入xx毫升 萃取液（Reagent G）
• 運(yùn)用真空泵，將 萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟15至16一次
• 去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉殘余萃取液，更換新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升65℃預(yù)熱的 緩沖液（Reagent A）到離心柱
• 室溫下靜置1分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉離心柱
• 加入xx微升 變性液（Reagent B）到離心管，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升 濃縮液（Reagent H）
• 加入xx微升 助沉液（Reagent I）
• 加入xx微升 沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩30秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent K）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入xx微升 保存液（Reagent L）
• 放進(jìn)－20℃冰箱保存

二、甲基化特異性PCR

• 將 擴(kuò)增液（Reagent M）、 補(bǔ)充液（Reagent N）、  U引物F（Reagent O）、  U引物R（Reagent P）、  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對(duì)一個(gè)樣本，準(zhǔn)備2個(gè)PCR管，分別標(biāo)記為U和M管
• 分別移出xx微升 擴(kuò)增液（Reagent M）到PCR管里
• 分別加入1微升上述轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入xx微升  U引物F（Reagent O）和  U引物R（Reagent P）到U管中
• 分別加入xx微升  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）到M管中
• 再分別加入xx微升 補(bǔ)充液（Reagent N）（反應(yīng)總量為25微升）
• 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級(jí)礦物油（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)9）
• 即刻進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)：

• 反應(yīng)完畢后，移取5微升進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳
• 陽(yáng)性條帶：轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）――125 bp；轉(zhuǎn)化后甲基型（M）――115 bp

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 一個(gè)特定基因的甲基化特異性PCR通常包括：轉(zhuǎn)化后甲基型（M）、轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設(shè)計(jì)原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個(gè)CpG位點(diǎn)；CpG位點(diǎn)須在3端；PCR片段長(zhǎng)度在80－250堿基
•   U引物F（Reagent O）、  U引物R（Reagent P）、  M引物F（Reagent Q）和  M引物R（Reagent R）的信息如下：

• 通過(guò)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴(kuò)增

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U”和“M”同時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性；
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 必要時(shí)，可以調(diào)整Tm溫度 
• 在－20℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
• 轉(zhuǎn)化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融
• 本公司同時(shí)提供系列基因甲基化分析試劑產(chǎn)品
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化保證
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高