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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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人體hTERT基因甲基化檢測(cè)試劑盒

時(shí)間:2017/1/18閱讀:1507
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人體hTERT基因甲基化檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

 

人體hTERT基因甲基化檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)化學(xué)方法使基因組中的所有胞嘧啶(CYTOSINE)轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(URACIL),而保留了所有甲基化的胞嘧啶,經(jīng)過(guò)甲基化特異性PCR擴(kuò)增,探測(cè)到人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT啟動(dòng)子CpG甲基化信息的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的??梢员挥糜?/span>人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究。產(chǎn)品即到即用,性能穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)便,轉(zhuǎn)化保證。

 

技術(shù)背景

 

在基因的啟動(dòng)子區(qū)域(promotor region)通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸“CG”的區(qū)域,稱為“CpGCpG island)。在人類基因組內(nèi),存在有近3萬(wàn)個(gè)CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標(biāo)志,而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),更是DNA甲基化的*位置。CpG島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human omerase reverse transcriptase;hTERT),又稱hTRT、hTCS1 和hEST2,是端粒酶的核心結(jié)構(gòu),即催化亞體(catalytic subunit)。hTERT的功能性表達(dá)是端粒酶獲得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶,使細(xì)胞獲得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速?zèng)Q定成分,其mRNA表達(dá)水平與端粒酶活性之間具有密切的相關(guān)性。hTERT是一單拷貝基因,定位于5q15.33,屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族,具有進(jìn)化上的保守性,序列總長(zhǎng)約35kb,由16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子組成。端粒酶特異性T-motif和7個(gè)同源保守序列的RT-motif分別位于不同的外顯子上。hTERTmRNA 還有7種不同的剪切轉(zhuǎn)錄本,分為缺失型與插入型兩類。一旦突變或甲基化,會(huì)造成細(xì)胞繁殖調(diào)控機(jī)制缺失,而致腫瘤或細(xì)胞衰老等。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液(Reagent A)

毫升

變性液(Reagent B)

微升

處理液(Reagent C)

毫升

轉(zhuǎn)化液(Reagent D)

毫升

封隔液(Reagent E)

毫升

凈化液(Reagent F)

毫升

萃取液(Reagent G)

毫升

濃縮液(Reagent H)

毫升

 助沉液(Reagent I)

微升

沉淀液(Reagent J)

毫升

清理液(Reagent K)

毫升

保存液(Reagent L

毫升

擴(kuò)增液(Reagent M)

微升

補(bǔ)充液(Reagent N)

毫升

U引物F(Reagent O)

微升

U引物R(Reagent P)

微升

M引物F(Reagent Q)

微升

M引物R(Reagent R)

微升

針筒離心柱

產(chǎn)品說(shuō)明書

1份

 

保存方式

 

保存 處理液(Reagent C)、 轉(zhuǎn)化液(Reagent D)、 助沉液(Reagent I)、 擴(kuò)增液(Reagent M)、 補(bǔ)充液(Reagent N)、  U引物F(Reagent O)、  U引物R(Reagent P)、  M引物F(Reagent Q)和  M引物R(Reagent R)在-20℃冰箱里; 凈化液(Reagent F)和 針筒離心柱保存在室溫下;其余的保存在4冰箱里; 處理液(Reagent C)和 轉(zhuǎn)化液(Reagent D)避免光照;有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管:用于樣品操作的容器

恒溫水槽:用于孵育反應(yīng)物

微型臺(tái)式離心機(jī):用于沉淀樣品或去除雜質(zhì)

渦旋震蕩儀:用于混勻反應(yīng)物

真空泵:用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞:用于去除樣品中的液體成分

PCR儀:用于樣品擴(kuò)增

PCR管或平板:用于PCR反應(yīng)的容器

測(cè)序試劑盒:用于測(cè)序前的產(chǎn)物處理

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前,將 處理液(Reagent C) 轉(zhuǎn)化液(Reagent D)從-20℃冰箱中取出,置入室溫下。同時(shí)將其中一管 緩沖液(Reagent A)置入65℃恒溫水槽中預(yù)熱備用。然后進(jìn)行下列操作:

 

  • 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

 

  • 準(zhǔn)備1個(gè)2.0毫升離心管
  • 加入2微克DNA樣品
  • 加入適量的 緩沖液(Reagent A)到50微升反應(yīng)體系(注意:不要使用65℃預(yù)熱的 緩沖液(Reagent A)
  • 加入xx微升 變性液(Reagent B),混勻
  • 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
  • 加入xx微升 處理液(Reagent C)(注意:可見溶液呈現(xiàn)黃色
  • 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒,充分混勻
  • 加入xx微升 轉(zhuǎn)化液(Reagent D),上下傾倒混勻
  • 加入xx微升 封隔液(Reagent E)
  • 放進(jìn)55℃恒溫水槽孵育16小時(shí)
  • 小心抽去xx微升 封隔液(Reagent E)
  • 加入xx毫升充分搖勻的 凈化液(Reagent F),上下傾倒混勻(注意: 凈化液(Reagent F)出現(xiàn)沉淀,37℃溫育后使用
  • 移入到針筒離心柱
  • 連接到真空泵,將柱內(nèi)液體抽去(或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體
  • 加入xx毫升 萃取液(Reagent G)
  • 運(yùn)用真空泵,將 萃取液(Reagent G)抽去(或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體
  • 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟15至16一次
  • 去掉針筒,將離心柱放在1.5毫升離心管
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心20秒,速度為16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
  • 去掉殘余萃取液,更換新的1.5毫升離心管
  • 加入xx微升65℃預(yù)熱的 緩沖液(Reagent A)到離心柱
  • 室溫下靜置1分鐘
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心20秒,速度為16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
  • 去掉離心柱
  • 加入xx微升 變性液(Reagent B)到離心管,混勻
  • 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
  • 加入xx微升 濃縮液(Reagent H)
  • 加入xx微升 助沉液(Reagent I)
  • 加入xx微升 沉淀液(Reagent J)
  • 在渦旋震蕩儀上震蕩30秒
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘,速度為16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
  • 小心抽掉上清液
  • 加入xx毫升 清理液(Reagent K)
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
  • 小心抽掉上清液
  • 空氣中晾干沉淀顆粒群
  • 加入xx微升 保存液(Reagent L)
  • 放進(jìn)-20冰箱保存

 

二、甲基化特異性PCR

 

  •  擴(kuò)增液(Reagent M)、 補(bǔ)充液(Reagent N)、  U引物F(Reagent O)、  U引物R(Reagent P)、  M引物F(Reagent Q)  M引物R(Reagent R)從-20℃冰箱里取出
  • 置入冰槽里直至融化
  • 針對(duì)一個(gè)樣本,準(zhǔn)備2個(gè)PCR管,分別標(biāo)記為U和M管
  • 分別移出xx微升 擴(kuò)增液(Reagent M)到PCR管里
  • 分別加入1微升上述轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中獲得的DNA樣品(總量100納克)
  • 分別加入xx微升  U引物F(Reagent O)  U引物R(Reagent P)到U管中
  • 分別加入xx微升  M引物F(Reagent Q)  M引物R(Reagent R)到M管中
  • 再分別加入xx微升 補(bǔ)充液(Reagent N)(反應(yīng)總量為25微升)
  • 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒,速度為500g(或2000RPM;例如eppendorf 5415)
  • 加入50微升PCR級(jí)礦物油(注意:參見注意事項(xiàng)9
  • 即刻進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR反應(yīng):

 

 

  • 反應(yīng)完畢后,移取5微升進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳
  • 陽(yáng)性條帶:轉(zhuǎn)化后非甲基型(U)――125 bp;轉(zhuǎn)化后甲基型(M)――115 bp

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20次操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 建議使用帶濾芯的槍頭,避免污染
  • 一個(gè)特定基因的甲基化特異性PCR通常包括:轉(zhuǎn)化后甲基型(M)、轉(zhuǎn)化后非甲基型(U)
  • 甲基化特異性PCR的引物設(shè)計(jì)原則:引物以SENSE的DNA鏈為模板;引物含有足夠多的C(后面不和G相連);引物含有1-3個(gè)CpG位點(diǎn);CpG位點(diǎn)須在3端;PCR片段長(zhǎng)度在80-250堿基
  •   U引物F(Reagent O)、  U引物R(Reagent P)、  M引物F(Reagent Q)  M引物R(Reagent R)的信息如下:

 

 

  • 通過(guò)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的,那么僅僅“U”Primers將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物;相反,已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴(kuò)增

         

  • 組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U”和“M”同時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性;
  • 根據(jù)用戶PCR儀的性能,決定是否加入礦物油(Mineral Oil)
  • 必要時(shí),可以調(diào)整Tm溫度 
  • 在-20℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
  • 轉(zhuǎn)化后的DNA保存在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融
  • 本公司同時(shí)提供系列基因甲基化分析試劑產(chǎn)品
  • 本公司提供系列甲基化分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化保證
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)核酶污染
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高

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