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上海宸功生物技術(shù)有限公司
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線粒體呼吸鏈復(fù)合物I 活性比色法定量檢測試劑盒

時間:2017/1/18閱讀:2017
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線粒體呼吸鏈復(fù)合物I 活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

線粒體呼吸鏈復(fù)合物I(NADH-輔酶Q 還原酶)活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q 同功類似物和特異性抑制劑,通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后峰值的降低,即采用比色法測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種純化線粒體樣品(動物、人體、酵母)以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-輔酶Q 還原酶的特異性活性檢測。其用于衰老、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶,嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,反應(yīng)優(yōu)化,檢測敏感。

 

技術(shù)背景

線粒體呼吸鏈復(fù)合物I,通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶(reduced nicotinamide adeninedinucleotide coenzyme Q reductase;NADH-CoQ reductase),又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase;NADH dehydrogenase),是線粒體電子傳遞鏈中zui大的結(jié)構(gòu)成分:含有30至40多個多肽結(jié)構(gòu)。其特征性的酶活性是魚藤酮敏感的NADH-輔酶Q還原酶(NADH:Q Reductase)。復(fù)合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶Q受體(泛醌;ubiquinone)的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng),為整個呼吸鏈反應(yīng)系統(tǒng)的*步?;谳o酶Q底物,在魚藤酮存在與否的情

況下,通過NADH-輔酶Q還原酶的催化,轉(zhuǎn)化成還原型泛醌(CoQH2),同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide;NAD),在分光光度儀下產(chǎn)生吸收峰值的變化(340nm 波長),由此定量測定NADH-輔酶Q還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是:

 

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液(Reagent A)

毫升

反應(yīng)液(Reagent B)

毫升

陰性液(Reagent C)

毫升

底物液(Reagent D)

微升

專性液(Reagent E)

微升

說明書

1 份

 

保存方式

保存在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融;反應(yīng)液(Reagent B)含有毒性物質(zhì),避免直接用手接觸;反應(yīng)液(ReagentB)和底物液(Reagent D),避免光照,有效保證6 月

 

用戶自備

比色皿:用于比色分析的容器

雙波長分光光度儀:用于比色分析

培養(yǎng)箱:用于孵育反應(yīng)物

 

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化;緩沖液(Reagent A)室溫預(yù)熱;反應(yīng)液(Reagent B)和底物液(Reagent D)注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

 

一、測定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好待測樣品(例如純化線粒體樣品等),置于冰槽里(注意:檢測前溶解線粒體;參見注意事項(xiàng)4)

2. 設(shè)定好雙波長分光光度儀(溫度為30℃):波長分別為340nm 和380nm,間隔30 秒,讀數(shù)7 次(共3分鐘),并置零(注意:參見注意事項(xiàng)10)

 

二、背景對照測定

1. 移取xx 微升緩沖液(Reagent A)到新的比色皿

2. 加入xx 微升反應(yīng)液(Reagent B)

3. 加入xx 微升底物液(Reagent D)

4. 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3 分鐘

5. 加入xx 微升陰性液(Reagent C)

6. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3 秒之內(nèi))

7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為背景空對照:

(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))0 分鐘-(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))1 分鐘或3 分鐘

 

三、樣品總活性測定

1. 移取xx 微升緩沖液(Reagent A)到新的比色皿

2. 加入xx 微升反應(yīng)液(Reagent B)

3. 加入xx 微升底物液(Reagent D)

4. 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3 分鐘

5. 加入100 微升待測樣品(注意:10 微克總線粒體蛋白;樣品須溶解;參見注意事項(xiàng)4)

6. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3 秒之內(nèi))

7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數(shù):

(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))0 分鐘-(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))1 分鐘或3 分鐘

 

四、樣品非特異活性測定

1. 移取xx 微升緩沖液(Reagent A)到新的比色皿

2. 加入xx 微升反應(yīng)液(Reagent B)

3. 加入xx 微升專性液(Reagent E)

4. 加入xx 微升底物液(Reagent D)

5. 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3 分鐘

6. 加入100 微升待測樣品(注意:10 微克總線粒體蛋白;樣品須溶解;參見注意事項(xiàng)4)

7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3 秒之內(nèi))

8. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為樣品非特異活性讀數(shù):

(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))0 分鐘-(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))1 分鐘或3 分鐘

 

五、計(jì)算樣品活性

1)樣品活性(總活性或非特異活性)

2)樣品特異活性

 

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為30 次(15 個樣本)操作,包括背景對照測定

2. 操作時,須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1 次

4. 線粒體樣品檢測前,須溶解;建議凍存融解(-70℃至37℃)循環(huán)3 次或使用線粒體溶解試劑盒

5. 加入樣品啟動反應(yīng)后3 秒內(nèi)即刻比色測定

6. 通常反應(yīng)1 分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定;測定值由高到低變化;測定可以持續(xù)3 分鐘

7. 測定值由高到低變化,即3 分鐘測定讀數(shù)低于0 分鐘測定讀數(shù),表明有酶活性

8. 比色測定后,比色皿須清洗*

9. 通常比色測定的OD340 起始讀數(shù)0.5 為理想狀態(tài)

10.如果用戶沒有雙波長同步測定分光光度儀,可以使用單波長340nm 替代,注意活性計(jì)算時,毫摩爾吸光系數(shù)變成6.2

11.建議待測樣本線粒體蛋白濃度為10 微克/100 微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量;注意計(jì)算公式的調(diào)整

12.如果使用細(xì)胞或組織裂解懸液,則蛋白濃度為50 微克/100 微升

13.樣品特異活性是指魚藤酮敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-輔酶Q 還原酶,去除其它干擾因素(例如復(fù)合物II/III/IV 等)

14.線粒體呼吸鏈復(fù)合物I(NADH-輔酶Q 還原酶)單位活性定義為:在30℃,pH 7.5 條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個活性單位

15.本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確

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