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上海宸功生物技術(shù)有限公司
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冰凍切片線粒體內(nèi)膜功能(膜電位)熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品操作手冊(cè)

時(shí)間:2019/8/1閱讀:1374
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冰凍切片線粒體內(nèi)膜功能(膜電位)熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

 

主要用途

 

冰凍切片線粒體內(nèi)膜功能(膜電位)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)高度敏感的陽(yáng)離子熒光羰花青染料結(jié)合到線粒體基質(zhì),其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體膜電位的變化,即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低來(lái)分析冰凍組織樣品線粒體內(nèi)膜功能的完整性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種冰凍動(dòng)物組織線粒體的功能檢測(cè)。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,活體檢測(cè),操作極為簡(jiǎn)易,性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

陽(yáng)離子熒光羰花青染色劑JC-15,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是一種對(duì)膜電位高度敏感的染色劑。它特異性地進(jìn)入線粒體,分布和結(jié)合在線粒體基質(zhì)上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高,JC-1形成聚集體,而濃度高,熒光顯色為紅色或桔紅色;反之,則為綠色。熒光減弱表明線粒體內(nèi)膜功能受到損害。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

染色液(Reagent A)     40微升

稀釋液(Reagent B)      5毫升

清理液(Reagent C)      20毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent C)在4℃冰箱里,其余的保存在-20冰箱里;染色液(Reagent A)避免光照;有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于工作液配制的容器

培養(yǎng)箱:用于染色孵育

(共聚焦)熒光顯微鏡:用于冰凍切片組織細(xì)胞線粒體熒光定性分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(Reagent A置入冰槽里融化,稀釋液(Reagent B放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10微升染色液(Reagent A到新的1.5毫升離心管,加入890微升稀釋液(Reagent B,混勻后,在冰槽里靜置,并標(biāo)記為染色工作液,放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 準(zhǔn)備5片待測(cè)的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片
  • 置于室溫下,小心加上500微升預(yù)冷的清理液( Reagent C,鋪滿整個(gè)切片表面
  • 小心移去切片上的清理液(Reagent C
  • 小心加上200微升室溫預(yù)熱的染色工作液,鋪滿整個(gè)切片表面
  • 37℃濕潤(rùn)培養(yǎng)箱里,孵育20分鐘(注意:避免液體蒸發(fā)
  • 小心移去切片上的染色工作液,避免光照
  • 小心加上500微升清理液(Reagent C,鋪滿整個(gè)切片表面
  • 小心移去切片上的清理液(Reagent C
  • 放上蓋玻片或封片(注意:檢測(cè)前置于冰槽里
  • 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察(單濾波或雙濾波):

 

觀察紅色熒光:濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490nm,散發(fā)波長(zhǎng)590nm或羅丹明(rhodamine)濾波器激發(fā)波長(zhǎng)540nm,

              散發(fā)波長(zhǎng)570nm或德州紅(Texas Red)濾波器激發(fā)波長(zhǎng)590nm,散發(fā)波長(zhǎng)610nm--可見(jiàn)

              亮紅色熒光;如果強(qiáng)度顯著減弱,表明線粒體膜電位受到破壞

 

觀察綠色熒光:濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490nm,散發(fā)波長(zhǎng)530nm或熒光素(Fluorescein)濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490nm,

              散發(fā)波長(zhǎng)520nm--如果綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),表明線粒體膜電位受到破壞,未結(jié)合JC

              -1染料在細(xì)胞漿里

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20次操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 染色工作液避免光照
  • 用戶根據(jù)實(shí)際需求,按比例配制試劑用量
  • 根據(jù)不同組織類型,調(diào)整染色工作液的使用劑量(110011000容量比),避免過(guò)度染色
  • 建議切片組織染色完成后,即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
  • 孵育時(shí),避免光照
  • 雙濾波或雙重測(cè)定:健康細(xì)胞和線粒體呈現(xiàn)紅色;死亡或凋亡細(xì)胞及損傷線粒體呈現(xiàn)綠色
  • 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

 

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