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PCR引物合成四步驟是什么?

2025-5-14  閱讀(10)

  PCR引物合成是指通過測定引物的OD值,溶解引物,最終合成引物的一個完善的過程。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。
 
  合成四步驟:
 
  第一步,
 
  是將預(yù)先連接在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯yi酸反應(yīng),脫去其5′-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5′-羥基。
 
  第二步,
 
  合成DNA的原料,亞磷酰胺保護核苷酸單體,與活化劑四氮唑混合,得到核苷ya 磷酸活化中間體,它的3′端被活化,5′-羥基仍然被DMT保護,與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
 
  第三步,
 
  帶帽(capping)反應(yīng),縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%),用yi酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng),這種短片段可以在后續(xù)環(huán)節(jié)根據(jù)實驗需要來選擇純化方式分離掉。
 
  第四步,
 
  在氧化劑碘的作用下,亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
 
  經(jīng)過以上四個步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯yi酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT,重復(fù)以上步驟,直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過an水高溫處理,連接在CPG上的引物被切下來,通過OPC, PAGE等手段純化引物,成品引物用C18濃縮,脫鹽,沉淀。沉淀后的引物用水懸浮,測定OD260定量,根據(jù)定單要求分裝。
 


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