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PCR引物合成四步驟是什么？
2025-5-14 閱讀(10)
PCR引物合成是指通過測定引物的OD值，溶解引物，最終合成引物的一個完善的過程。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。
合成四步驟:
第一步,
是將預(yù)先連接在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯yi酸反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。
第二步，
合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷ya 磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
第三步，
帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用yi酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在后續(xù)環(huán)節(jié)根據(jù)實驗需要來選擇純化方式分離掉。
第四步，
在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯yi酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過an水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。
