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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備步驟
2021-1-14 閱讀(290)
轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：
1. 器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp)，超凈工作臺(tái)，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。
2. 試劑
培養(yǎng)基(不加抗菌素)，LB培養(yǎng)基(加抗菌素)，無(wú)菌ddH2O，IPTG，X-gal。
3. 材料處理
無(wú)菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)，20%IPTG(M/V)，2% X-gal(M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配)。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞操作步驟：
1. 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。
2. 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100 μl)感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
3. 加入5 μl 連接好的質(zhì)?；旌弦?DNA含量不超過(guò)100 ng)，輕輕震蕩后放置冰上20 min。
4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。
5. 在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入500 μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。
6. 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液100-300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻。
7. 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻。
8. 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過(guò)來(lái)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。
9. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。
10. 觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開(kāi)為好。注意白色菌斑。
