ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開發(fā)初析
本文適用于已有過ELISA應(yīng)用相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，對ELISA問題排查和方法開發(fā)有進(jìn)一步需求的廣大科研人員，更加適用于ELISA相關(guān)醫(yī)療診斷試劑盒開發(fā)，體內(nèi)藥代藥動相關(guān)大分子檢測，抗體結(jié)合活性質(zhì)控等在合規(guī)方面有方法學(xué)驗(yàn)證要求的藥物研發(fā)工業(yè)領(lǐng)域從業(yè)者。ELISA檢測技術(shù)的間接性，應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛性，樣品來源的復(fù)雜性和試劑各成分反應(yīng)過程的可逆性導(dǎo)致ELISA的方法開發(fā)和實(shí)際的使用過程中會出現(xiàn)各種異常情況，本文的目的是區(qū)分ELISA的使用目的，明確目的相關(guān)ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分步解析ELISA間接檢測的信號傳遞過程以及傳遞偏差對檢測方法的影響，簡略探討免疫反應(yīng)（配體-受體結(jié)合）的化學(xué)本質(zhì)和數(shù)學(xué)原理，并重新評估棋盤法在ELISA方法開發(fā)的指導(dǎo)意義，倡導(dǎo)以使用目的為導(dǎo)向通過方法學(xué)驗(yàn)證為目標(biāo)的ELISA方法學(xué)開發(fā)。
ELISA應(yīng)用
ELISA檢測技術(shù)早在19世紀(jì)70，80年代就開發(fā)出來用于替代放射性同位素標(biāo)記技術(shù)用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用（配體-受體，抗原-抗體），到如今已經(jīng)接近50年的歷史了。這個技術(shù)從科研的角度來說已經(jīng)不具備性，沒有太多的價(jià)值，不值得專門進(jìn)行研究，更多的是一個使用的工具。工業(yè)應(yīng)用落后于基礎(chǔ)研究，ELISA技術(shù)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用隨著近20年生物制藥領(lǐng)域的迅猛發(fā)展展現(xiàn)著越來越多的使用價(jià)值，當(dāng)然ELISA的應(yīng)用情況也越來越復(fù)雜，這樣的復(fù)雜性也使得早期的基礎(chǔ)研究并不再具有很好的指導(dǎo)意義，ELISA方法濫用錯用往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，做出錯誤的選擇。本文的寫作目的旨在作為文獻(xiàn)之外關(guān)于ELISA實(shí)際應(yīng)用的一個總結(jié)，反補(bǔ)基礎(chǔ)研究的不足，使得該技術(shù)更具使用價(jià)值。
從早期抗體發(fā)現(xiàn)階段，雜交瘤的滴度測定，噬菌體展示的淘選篩選；抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn)和發(fā)酵過程的表達(dá)量監(jiān)控，體外抗體和對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白或細(xì)胞表面受體的親和力評價(jià)，細(xì)胞因子的監(jiān)控，體內(nèi)抗體藥物的藥代動力學(xué)，藥效生物標(biāo)志物的含量檢測和免疫原性測定等均會使用ELISA技術(shù)。ELISA技術(shù)可以說是一個通用的，入門十分簡單，應(yīng)用面十分廣泛，高通量的技術(shù)。小木蟲，丁香園等關(guān)于ELISA的問題經(jīng)久不衰，ELISA技術(shù)由于其檢測的間接性（信號進(jìn)行了多重傳遞），使用目的的差異性和樣品來源的復(fù)雜性導(dǎo)致ELISA方法一旦出現(xiàn)異常實(shí)驗(yàn)地操作者很多時候很難進(jìn)行問題排除。小編有過多年的ELISA相關(guān)應(yīng)用方法學(xué)的開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行了多個ELISA應(yīng)用的開發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證，從一個ELISA方法開發(fā)和ELISA平臺技術(shù)搭建者的角度，對ELISA方法應(yīng)用進(jìn)行梳理和系統(tǒng)分析。
使用目的
從使用目的來說，ELISA方法可以分為兩類。類：生物大分子的定量，第二類：親和力測定評價(jià)或者篩選。抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)、瞬和發(fā)酵過程的表達(dá)量監(jiān)控，細(xì)胞因子的監(jiān)控，體內(nèi)抗體藥物的藥代動力學(xué)，藥效生物標(biāo)志物的含量檢測和免疫原性測定等可劃分為類使用目的，雜交瘤的滴度測定，噬菌體展示的淘選篩選，體外抗體和對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白或細(xì)胞表面受體的親和力評價(jià)可劃分為第二類使用目的。使用目的不一樣，即使使用同樣的試劑材料，也會有不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ胶蛿M合曲線。下面小編將以某抗體的定量的方法開發(fā)（類目的）和親和力檢測方法開發(fā)（第二類目的）為例，對不同使用目的開發(fā)策略進(jìn)行介紹。
該方法的檢測體系如下，靶點(diǎn)蛋白（抗原）包被，樣品（人抗體）進(jìn)行反應(yīng)，酶聯(lián)二抗為羊抗人HRP偶聯(lián)多抗，顯色液為TMB顯色液。使用目的是對樣品進(jìn)行定量和親和力分析。
如表一，表二，采用相同的試劑材料，不同的試劑相對濃度得到了如圖1不一樣的劑量曲線來滿足不同的使用目的。而兩個方法核心的不同在于包被抗原的量相對于梯度稀釋樣品的量，如果一個ELISA需要達(dá)到精密，準(zhǔn)確等驗(yàn)證需求，在定量方法的開發(fā)過程中包被抗原的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)品（樣品）的量，這樣樣品能夠抵消抗原抗體可逆反應(yīng)的影響，使得近似所有的抗體樣品均被捕捉到，標(biāo)準(zhǔn)曲線如果做對數(shù)線性擬合能夠得到非常好的線性。在親和力評價(jià)中，這跟同位素標(biāo)記測配體受體的親和力的原理一致，包被少量的包被抗原，采用飽和浸潤法即包被抗原的量相對于樣品的量是由遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于抗原的量到遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗原的量的過程，需要有完整的上下漸進(jìn)線，S型曲線，其EC50即親和力數(shù)值（解離平衡常數(shù)）。兩個使用目的采取的實(shí)驗(yàn)條件涉及到抗原抗體可逆反應(yīng)化學(xué)原理的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，鑒于多寫一個數(shù)學(xué)公式可能會使讀者少上不少，公式推導(dǎo)已做省略，不同使用目的的假設(shè)推導(dǎo)過程也給出，有志于深耕ELISA領(lǐng)域的讀者可以好好研究下。
采用相同的實(shí)驗(yàn)材料，不同的試劑配比以分別達(dá)到生物大分子定量和親和力評價(jià)的使用目的并進(jìn)行對比的研究，至目前為止，小編并未在任何文獻(xiàn)上見到過類似的研究，但是在實(shí)際的應(yīng)用過程中達(dá)到了很好的效果，這也是小編想把這篇文章寫下來，期望借助互聯(lián)網(wǎng)的力量把這個不具有很大的科學(xué)價(jià)值但是有很廣泛的使用價(jià)值的技術(shù)進(jìn)行傳播討論，達(dá)到越辯越明的目的。
ELISA方法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)
當(dāng)然，從一個藥物研發(fā)從業(yè)者的角度來看，開發(fā)出來的方法需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，符合相關(guān)法律法規(guī)后才能夠確認(rèn)成功，這是從質(zhì)量分析控制的尺度去對一個ELISA方法進(jìn)行評估，可以說是為嚴(yán)格的評估方式。這個工作可能主要集中在質(zhì)量控制相關(guān)的部門，涉及到一個檢驗(yàn)方法好壞的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，小編正好也負(fù)責(zé)過幾個ELISA方法的驗(yàn)證工作，簡單介紹下，涉及到相關(guān)的法律法規(guī)，具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和程序以法規(guī)為準(zhǔn)。
生物大分子定量方法學(xué)驗(yàn)證
ELISA方法的類使用目的是生物大分子定量，這個可以參考2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國FDA版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。里面有比較細(xì)致關(guān)于生物大分子定量方法的準(zhǔn)確度，精密度，線性和范圍，耐用性等方面的驗(yàn)證要求。在小編看來，在ELISA 定量開發(fā)出來后如果初步判斷一個檢測方法能否通過驗(yàn)證，主要看兩點(diǎn)，點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)品的曲線擬合后的回測偏差是否在比較合適和穩(wěn)定范圍內(nèi)（±10%），第二就要看標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品在檢測體系中是否具有相同的免疫學(xué)特性（平行性）。這個可以通過梯度稀釋樣品信號代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后測定的濃度值在各稀釋倍數(shù)是否吻合來判斷。相同的免疫學(xué)特性是一個非常重要的概念，也是一個方法開發(fā)是否成功的關(guān)鍵。免疫學(xué)特性不僅僅指的待測樣品和包被抗原的親和力特性，也包含待測樣品和酶聯(lián)抗體的親和力特性。即使是同樣的物質(zhì)，當(dāng)樣品經(jīng)過體內(nèi)代謝循環(huán)后其免疫學(xué)特性有可能發(fā)生改變，那么未經(jīng)體內(nèi)代謝的對照品是否能夠作為標(biāo)準(zhǔn)品需要經(jīng)過平行性驗(yàn)證。即使不同的物質(zhì)，只要有相同的免疫學(xué)特性，也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量，小編就搭建了雙抗Fc方法(包被為抗Fc抗體，酶聯(lián)抗體也為抗Fc抗體-HRP)作為通用方法，IGg作為對照品進(jìn)行多個抗體和融合蛋白的常規(guī)檢測，經(jīng)過分子量校準(zhǔn)后的檢測結(jié)果和純化后紫外的檢測結(jié)果有可比性。
親和力測定驗(yàn)證（相對結(jié)合活性方法學(xué)驗(yàn)證）
親和力指得是抗體和靶點(diǎn)抗原的解離平衡常數(shù)，是一個非常重要的生物特性。在質(zhì)量控制過程中，常用ELISA方法進(jìn)行不同批次或者長期穩(wěn)定性樣品的親和力評價(jià)。親和力一般來說是值，但是由于生物實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，材料批次的替換可能會影響到樣品的親和力檢測準(zhǔn)確性，常會引入一個默認(rèn)質(zhì)量屬性不會變化的對照品作為參比品，待測樣品和參比品一同進(jìn)行檢測來抵消材料造成的偏差，并計(jì)算待測樣品相對于參比品的親和力（相對結(jié)合活性）
生物功能學(xué)方法的評價(jià)中國藥典目前沒有詳細(xì)的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，只有宏觀的分析方法準(zhǔn)確度，精密度，線性和范圍，耐用性等要求，F(xiàn)DA在USP1032,USP1033,USP1034有比較詳細(xì)和完整的生物功能學(xué)方法驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的案例，可以用來評價(jià)ELISA建立的親和力評價(jià)方法的質(zhì)量。
系統(tǒng)分析：信號進(jìn)行了多重傳遞和傳遞過程可能出現(xiàn)的偏差
ELISA是一個間接的檢測過程，這在很多文獻(xiàn)資料上都有這樣的記載。但是很少有研究資料詳細(xì)的描述間接測量的信號傳遞過程，以及傳遞過程中出現(xiàn)的偏差。這里小編從宏觀和微觀兩個角度對ELISA進(jìn)行系統(tǒng)分析，該分析有助于搭建穩(wěn)定的ELISA平臺，并正確地使用和評估不同性質(zhì)的酶聯(lián)抗體和顯色液等通用材料。
如圖2所示，宏觀上來講，ELISA檢測的函數(shù)曲線在實(shí)際操作過程中描述的是劑量濃度的抗體和信號之間的相關(guān)關(guān)系，而其實(shí)質(zhì)是為了描述劑量濃度的抗體和對應(yīng)抗原-抗體偶聯(lián)物之間的相關(guān)關(guān)系?？乖?抗體偶聯(lián)物經(jīng)過了酶聯(lián)抗體反應(yīng)和酶催化放大反應(yīng)，催化產(chǎn)物檢測后轉(zhuǎn)換成信號。該信號間接的代表了抗原-抗體偶聯(lián)物。這種間接的轉(zhuǎn)化過程經(jīng)歷了三重信號的傳遞過程，而只有在三重傳遞保證線性的情況，抗體濃度-信號劑量曲線才能等同于抗體濃度-抗體抗原偶聯(lián)物濃度劑量曲線，如果進(jìn)行了非線性傳遞將會影響到整個檢測方法的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，下面小編將從微觀角度簡單介紹下信號傳遞過程中可能存在的偏差。
1.信號檢測偏差：酶催化產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成信號時有可能會產(chǎn)生的偏差，這個偏差在一些文獻(xiàn)中也稱之為儀器的非線性檢測區(qū)域，即當(dāng)酶催化產(chǎn)物濃度過高時，催化產(chǎn)物濃度和信號值之間不*呈線性關(guān)系，這個現(xiàn)象是普遍存在的，如圖3所示某品牌酶標(biāo)儀的參數(shù)性能，注意該儀器的測量范圍是0-4 OD，而該儀器確保的檢測線性范圍是0-3 OD。一般來講在進(jìn)行吸光度法讀數(shù)時，檢測的信號值值控制在3左右。如果兩個相鄰的抗體濃度點(diǎn)對應(yīng)的信號值在OD值3.5及以上時都會特別接近，這兩個信號值很有可能是有信號傳遞偏差的。這個可以通過高濃度的酶催化產(chǎn)物梯度稀釋查看信號的線性范圍確認(rèn)。
2.酶催化反應(yīng)傳遞偏差：該偏差是由酶催化顯色液引起的，其實(shí)質(zhì)是酶聯(lián)抗體的濃度和其對應(yīng)催化產(chǎn)物的濃度是否線性相關(guān)。如圖4所示由于酶催化反應(yīng)在未終止前是一個持續(xù)反應(yīng)的信號放大過程，信號的產(chǎn)生是時間的累積量，在反應(yīng)過程中酶活可能會喪失（左），顯色液的有效成分在不斷的減少時，梯度濃度的酶催化反應(yīng)在反應(yīng)時間內(nèi)的可能不會是勻速反應(yīng)狀態(tài)（右）。
這個可以通過動力學(xué)讀數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。目前市面上有多種顯色液可供選擇，顯色能力強(qiáng)和弱的產(chǎn)品信號差異可能達(dá)到20-50倍，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的正確的選擇顯色液并確認(rèn)酶催化過程的線性傳遞。
3.酶聯(lián)抗體反應(yīng)傳遞偏差，即酶聯(lián)抗體和抗體抗原偶聯(lián)物反應(yīng)后，酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物的濃度能否線性的代表抗體抗原偶聯(lián)物的濃度。這個比較復(fù)雜的過程，主要是因?yàn)槊嘎?lián)抗體的異質(zhì)性導(dǎo)致的，酶聯(lián)抗體多為多抗，該抗體偶聯(lián)上的HRP分子數(shù)目也存在差異，很難用單一的實(shí)驗(yàn)去論證這個線性過程。但值得注意的是，酶聯(lián)抗體加入反應(yīng)濃度應(yīng)該遠(yuǎn)大于抗體抗原偶聯(lián)物的濃度，這樣能夠保證基本所有的抗體抗原偶聯(lián)物都被轉(zhuǎn)換成酶聯(lián)抗體-抗原抗體偶聯(lián)物，酶聯(lián)濃度加入過少會導(dǎo)致劑量曲線的高濃度點(diǎn)出現(xiàn)假平臺期，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；酶聯(lián)濃度過高可能會導(dǎo)致非特異信號的增加，還有酶聯(lián)濃度的增加會導(dǎo)致信號的增加，可能會導(dǎo)致信號值超過線性檢測范圍。所以酶聯(lián)濃度的反應(yīng)濃度是一個值得選擇的參數(shù)。
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