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PCR擴(kuò)增產(chǎn)物平端連接法克隆實(shí)驗(yàn)原理
2023-2-14 閱讀(603)
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物平端連接法克隆實(shí)驗(yàn)原理：
平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對(duì)能力，擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個(gè)堿基的DNA分子。
這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過(guò)較高，在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。
對(duì)于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X-gal和IPTG篩選，?？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。
