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PCR 反應體系條件優(yōu)化
2024-3-29 閱讀(292)
PCR 反應體系由反應緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）五部分組成。各個組份都能影響 PCR 結果的好壞。PCR反應需要一定的條件才能完成，這些條件主要有以下方面：
一、緩沖液
任何一個生化反應都必須在一定的緩沖體系中進行，緩沖體系除了提供一定的pH緩沖能力外，還有一些有助于反應進行的成分。PCR反應緩沖液通常采用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室溫）緩沖液體系，其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二價陽離子，一般采用Mg2+，以MgCl2的形式提供，Mg2+的濃度高低可顯著影響 PCR擴增產(chǎn)物的特異性，此外，緩沖液中還含有50 mmol/L的K+，有利于引物與模板的退火。有些緩沖液中還加入明膠或血清白蛋白（100 μg/mL）及去污劑（如Twcen20 等），對Taq DNA聚合酶起穩(wěn)定作用。
二、模板
PCR模板是含有待擴增序列的 DNA、mRNA或cDNA等，模板數(shù)量可直接影響擴增的效果。對于一般的 PCR擴增，104～107個模板分子可達到滿意的效果，一般宜用納克（ng）級的克隆DNA、微克（μg）水平的染色體DNA或102～105拷貝待擴增的DNA片段作為起始材料。除了數(shù)量外，模板的質量也非常重要，不能有太多的蛋白質和其他污染，特別是其他DNA的污染，即使是痕量的DNA，也會導致非特異性產(chǎn)物。
三、dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的總稱。貯備液為pH 7.0 左右，其濃度一般為20 mmol，-20℃保存。體系中為20~200 μmol即可，過低則反應速度下降，濃度過高則特異性下降，因為dNTP能絡合溶液中的Mg2+，產(chǎn)生錯配或抑制Taq DNA聚合酶活性。
四、耐熱的DNA聚合酶
PCR反應中使用的 DNA聚合酶必須耐高溫，在90℃以上的高溫下仍能有活性，正是由于耐熱DNA聚合酶的應用才使 PCR技術得以實現(xiàn)，目前使用的耐高溫DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。
五、引物
PCR反應的最佳條件
根據(jù)大量的研究報道，PCR反應的最佳條件為：①Taq DNA聚合酶的濃度為1.0-2.5 U/100μL反應液；②dNTP的濃度為20～200 μmol/L；③Mg2+濃度為0.5～2.5 mmol/L；④引物的濃度為0.2～1.0 μmol/L。在準備具體的PCR反應時，還要針對模板特性、PCR儀等進行上述反應體系的優(yōu)化，并設置試驗確定連退火溫度、延伸時間，建立其相應的PCR反應優(yōu)程序。
