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上海博湖生物科技有限公司
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PCR反應(yīng)DNA體外復(fù)制條件有什么？
2024-7-22 閱讀(492)
PCR原理是DNA分子兩條單鏈以雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)成，DNA兩條鏈擁有自行粘附的特性，A與T配對(duì)，C與G配對(duì)，DNA粘附特性是PCR的核心原理。同時(shí)DNA復(fù)制時(shí)也是具有方向性的，DNA序列的開始端稱為5‘端，末端稱為3’端。
在復(fù)制時(shí)，需要加入一種叫做引物(primers)的東西?？梢詫⒁锢斫鉃橐粋€(gè)短序列，下圖中紅色的部分就是引物。引物通常15到20個(gè)堿基，可以短一些，也可以長(zhǎng)一些。但是必須和我們想合成的DNA片段成互補(bǔ)關(guān)系。將引物與DNA鏈混合時(shí)，會(huì)自動(dòng)粘在上面，因?yàn)樗麄兪腔パa(bǔ)的。引物獲得可以從公司訂購(gòu)，后續(xù)有機(jī)會(huì)我們也會(huì)分享引物設(shè)計(jì)方法。下面了解PCR反應(yīng)DNA體外復(fù)制的所需條件如下：
一、模板和底物
DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須以親代DNA鏈作為模板，親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。同時(shí)，DNA復(fù)制需要以四種脫氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，為底物合成子代DNA。
在體外進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，模板和底物均可通過人工添加解決。
二、引物
DNA聚合酶必須以一段具有3’端自由羥基(3’-OH)的RNA作為引物，才能開始合成子代DNA鏈。
在體外進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作為引物，該引物序列與進(jìn)行擴(kuò)增的目的核酸片段互補(bǔ)匹配，從而開始目的片段的擴(kuò)增。
因?yàn)橐锏膲A基序列需要與目的片段相匹配，在合成引物之前，必須首先已知目的片段的堿基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，從而確定合成引物的堿基序列。
三、模板雙鏈的解旋
在DNA的半保留復(fù)制機(jī)制中，雙鏈DNA的解旋是在拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶的作用下完成的，該過程需要拓?fù)洚悩?gòu)酶識(shí)別DNA的復(fù)制起點(diǎn)才能開啟，而體外擴(kuò)增特定的核酸片段只需要特異性的復(fù)制目的核酸片段，因而需要一種方式使得模板DNA解旋為單鏈DNA，之后在使之與引物結(jié)合，從而特異性的擴(kuò)增目的核酸片段。
三、DNA的變性
DNA變性是指核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基對(duì)的氫鍵斷裂，使得雙鏈變?yōu)閱捂湹倪^程。
對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行加熱可以使其發(fā)生變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時(shí)，DNA在260nm處的吸光度會(huì)突然發(fā)生明顯的上升，并達(dá)到最大值，之后溫度繼續(xù)上升，其吸光度也不會(huì)發(fā)生明顯變化，若以溫度對(duì)DNA溶液的260nm吸光度做圖，會(huì)得到典型的DNA變性S型曲線。
DNA的變性是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的，通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值50%時(shí)的溫度稱為核酸的熔解溫度 (Tm, melting temperature)。
1. 特定核酸分子的Tm值與其G+C含量成正相關(guān)，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；
2. Tm值的大小還與核酸分子的長(zhǎng)度有關(guān)，核酸分子越長(zhǎng)，Tm值越大；
3. 粒子強(qiáng)度越高，熔解溫度越高，熔解溫度范圍越窄。
四、DNA的復(fù)性
加熱變性的DNA在緩慢冷卻后可以由單鏈恢復(fù)為雙鏈結(jié)構(gòu)，這一過程稱為DNA的復(fù)性，也稱為“退火 (annealing)"。
當(dāng)溫度降低至比變性DNA的Tm低25℃時(shí)，其復(fù)性效果*佳，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性效果越差。
因此，可以利用此特性，在加熱使模板DNA變性后，將溫度降低至特定溫度，從而使所加引物與模板DNA復(fù)性結(jié)合，進(jìn)而能夠?qū)σ锼?guī)定的核酸片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增。
五、DNA聚合酶
為了使模板中特定的核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，在模板與引物結(jié)合后，需要有DNA聚合酶的參與，但是由于DNA變性和復(fù)性過程的溫度較高，普通的DNA聚合酶在此過程中會(huì)由于溫度過高而失活。
科學(xué)家為了解決該問題，從水生棲熱菌 (Thermus Aquaticus) 中分離出了具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活。
