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上海博湖生物科技有限公司
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PCR擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性條帶情況解讀
2025-3-31 閱讀(98)
實(shí)驗(yàn)方法原理：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個(gè)步驟，通過(guò)將這一套過(guò)程不斷循環(huán)，使DNA得以成百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：
一是引物與靶序列不全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
其對(duì)策有：
①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。
②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。
③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。
其對(duì)策有：
①減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。
②減少dNTP的濃度。
③適當(dāng)降低Mg2+濃度。
④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
