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癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組 DNA 轉(zhuǎn)染法實驗步驟
2021-6-17 閱讀(1044)
癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組 DNA 轉(zhuǎn)染法實驗步驟：
1、 提取基因DNA(含癌基因).
2、 DNA準(zhǔn)備:取供體DNA50～100微克,加3M NaCl或醋酸鈉使最終濃度至0.3M混勻.
3、 再加2倍體積無水乙醇,3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,去上清.
4、 加入轉(zhuǎn)染緩沖液,待DNA充分融解后,再加入2.5M CaCl2,令最終濃度為125mM,用吸管輕輕吹打三次.置室溫下10～30分鐘,待液體透明度降低,出現(xiàn)微濁藍(lán)色時,即可用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞.
5、 細(xì)胞:取生長狀態(tài)良好、處于半?yún)R合階段的指數(shù)增生期細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染前24小時,更換培養(yǎng)液1次.
6、 轉(zhuǎn)染:向每瓶中加DNA－磷酸鈣沉淀物0.5～1ml/瓶,置37℃作用4～6小時.
7、 培養(yǎng):棄去培養(yǎng)液,用15％甘油處理3分鐘,無血清培養(yǎng)漂洗1次,加入新培養(yǎng)液,37℃溫箱培養(yǎng)24小時.
8、 傳代:按1:5或1:10分瓶傳代,每2～3天換液1次,接近匯合時血清用量降至5％,培養(yǎng)2～3周.
9、 檢測:逐日觀察,待出現(xiàn)轉(zhuǎn)化灶后,分離入另瓶中培養(yǎng).
