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上海雅吉生物科技有限公司
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細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定
2019-9-12 閱讀(214)
一、原理
培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。
在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。
用臺盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
1. 儀器與用品：普通顯微鏡. 血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管、酶標(biāo)儀（或分光光度計(jì)）
2. 試劑：0.4%臺盼蘭，0.5%四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇
3. 材料：細(xì)胞懸液
三、操作步驟
（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)
1. 將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。
2. 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。
3. 靜置3分鐘。
4. 鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。
（二）細(xì)胞活力
1. 將細(xì)胞懸液以0.5 ml 加入試管中。
2. 加入0.5 ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2~3分鐘。
3. 吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4. 鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。
死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。
（三）MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。
1. 細(xì)胞懸液以1000 rpm 離心10分鐘，棄上清液。
2. 沉淀加入0.5~1 ml MTT，吹打成懸液。
3. 37℃下保溫2小時(shí)。
4. 加入4~5 ml 酸化異丙醇（定容）。打勻。
5. 1000 rpm 離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)570 nm 比色，酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn)。
注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞數(shù)。
附：
1. 0.4%臺盼蘭染液配制：
臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml。
2. MTT配制：
MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。
3. 酸化異丙醇配制：
異丙醇中加入HCl使終達(dá)0.04 mol/L。
