亚洲国产精品二区久久,日本美女后入式午夜视频在线观看,国产污视频在线观看,欧美日韩国产精品中文字幕在线观看

實(shí)驗(yàn)方法原理 TA克隆 系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR 產(chǎn)物的克隆 和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR 產(chǎn)物的3'末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3'T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆 位點(diǎn)（MCS）中。

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個不同大小的片斷相連。因?yàn)镈NA斷有兩個端點(diǎn)，所以切割時出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導(dǎo)致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對載體進(jìn)行5'除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA斷的3'OH末端與5'端，所以除磷后載體不會自環(huán)。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5'端就能與載體進(jìn)行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個特點(diǎn)是能將供體分子定向連接到載體上。
 
連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。
實(shí)驗(yàn)材料 外源DNA斷
試劑、試劑盒 pMD 18-T VectorLigation bufferT4 ligateaserATP
儀器、耗材 超凈工作臺離心機(jī)恒溫?fù)u床恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿試管離心管電泳儀電泳槽凝膠樣品梳移液器
實(shí)驗(yàn)步驟 
一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
 
1.  取大腸桿菌JM109保存液50 ul，接種于4 ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37℃，300 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，第二天取50 ul 轉(zhuǎn)接到新的4 ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3 h至OD600=0.35～0.4，在無菌操作臺上取1 ml菌液于1.5 ml離心管中，冰浴10 min。
 
2.   4℃，5 000 rpm離心2 min，去上清液。
 
3.  加入750 ul預(yù)冷的0.1 M CaCl2重懸菌體，冰浴30 min。
 
4.   4℃，5 000 rpm離心2 min，棄上清液。
 
5.  加入100 ul 冰冷的0.1 M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2 h后，4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 
二、重組DNA的轉(zhuǎn)化
 
1.  將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃預(yù)熱。
 
2.   于100 ul感受態(tài)細(xì)胞中加入10 ul連接產(chǎn)物，冰浴30 min。
 
3.  將離心管轉(zhuǎn)入42℃水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管，迅速將其放在冰上2 min。
 
4.  在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300 ul，槍頭混勻，37℃、150 rpm溫和搖振60 min。
 
5.  將200 ul 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落進(jìn)行鑒定。
 
三、重組質(zhì)粒的鑒定
 
方案一： 菌落PCR
 
（1） 制備PCR混合液。
 
（2） 用經(jīng)滅菌的10 ul 槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
 
（3） 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。
 
（4） 將步驟 ⑶ 的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。
 
（5） 按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3 min；然后進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94℃變性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5 min。
 
（6） 取5 ul PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。
 
方案二： 質(zhì)粒PCR
 
1.  堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA
 
（1）用離心管收集4 ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過夜的菌液，14 000 rpm離心30秒，棄盡上清。
 
（2）用250 ul 已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。
 
（3）加入250 ul Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，此步驟不宜超過5 min。*Buffer S2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。
 
（4）加入400 ul Buffer S3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次，室溫靜置2 min，14 000 rpm離心10 min。
 
*若離心后凝結(jié)塊未沉淀到離心管底部，應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，12000g離心3min。
 
（5）將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5 500 rpm離心1 min。
 
（6） 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入500 ul Buffer W1，5500 rpm離心1 min。
 
（7）棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入700 ul 已加無水乙醇的Buffer W2，5 500 rpm離心1 min，以同樣的方法再用700 ul已加無水乙醇的BufferW2洗滌一次。
 
（8） 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，14 000 rpm離心1 min。
 
（9）連濾液一并棄掉收集管，將DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 離心管中，在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去離子水。
 
（10）室溫靜置2 min，14 000 rpm離心1 min洗脫DNA。
 
（11） 取5 uL樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉(zhuǎn)化子。
 
2.  抽提純化質(zhì)粒DNA酚、抽提可以去除堿裂解法制備的質(zhì)粒DNA中殘留的蛋白質(zhì)。
 
（1） 加TE稀釋質(zhì)粒DNA溶液至300 uL。
 
（2）加等體積的酚::異戊醇（25:24:1），震蕩混勻，靜置3 min。
 
（3）14 000 rpm 離心5 min，吸上清液，加等體積的酚::異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3 min。
 
（4） 14 000 rpm離心5 min，吸上清液，加等體積的:異戊醇（24:1），混勻，靜置3 min。
 
（5） 14 000rpm離心5 min，吸上清液，加2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后-20℃放置15 min，沉淀質(zhì)粒DNA。
 
（6） 14 000rpm離心13 min，棄上清液，沉淀加入200 uL 70%乙醇洗滌一次，室溫干燥，用20 uL去離子雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA沉淀，-20℃保存待用。
 
（7） 取5 ul樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結(jié)果。
 
3.  質(zhì)粒PCR
 
（1） PCR反應(yīng)體系如下：
 
（2）PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；然后進(jìn)行30 個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：
 
94℃變性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5 min。
 
（3） 取5 ul PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，方法與試驗(yàn)二相同。
收起
注意事項(xiàng) 
1.  要獲得目的基因的TA克隆 ，PCR 產(chǎn)物的特異性要好。
 
2.  PCR 產(chǎn)物在TA克隆 前要通過純化。
 
3.  在PCR 產(chǎn)物回收、純化過程中防止外來DNA污染。
 
4.   制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。
 
5.  42℃熱處理時很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。
 
6.   菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械擠壓涂布會使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。

8.  Ligation Solution I 請于冰中融解。
 
9.  在進(jìn)行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.15 pmol。
 
10.  克隆時使用的Insert DNA段 (PCR 產(chǎn)物) 盡量進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會影響TA克隆的效率。
 
11.  按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時的連接液不要超過20 ml。當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA用量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
 
12.   連接反應(yīng)請在16℃下進(jìn)行，溫度升高 (>26℃) 較難形成環(huán)狀DNA。
 
13.   連接效率偏低時，可適當(dāng)延長連接時間至數(shù)小時。
 
14.   感受態(tài)細(xì)胞可使用適合于pUC系列載體的感受態(tài)細(xì)胞，如：JM109，DH等。
收起
其他 
一、常見問題

1.  怎樣提高pMD18-T Vector的克隆效率?
 
。
 
（2）除去殘存的引物等雜質(zhì)。
 
（3）DNA段的立體結(jié)構(gòu)、DNA段的長短都會影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，建議采用電轉(zhuǎn)化方法。
 
 
2.  PCR產(chǎn)物難以插入載體，為什么?
 
（1）確認(rèn)PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物不能直接用于TA克??；PCR產(chǎn)物保存時間不要過長，長時間保存的PCR產(chǎn)物會脫去末端的"A"堿基。
 
（2）PCR產(chǎn)物中短片段雜質(zhì)DNA太多，這時應(yīng)切膠回收純化DNA段，回收時PCR產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時間過長。
 
（3）確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，使用的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/mg pUC118 DNA。
 
（4）確認(rèn)Ligation Solution I 的連接效率是否降低，多次反復(fù)凍融會降低的Ligation Solution I 連接效率。
 
（5）確認(rèn)抗生素的濃度是否過大。
 
（6）使用新配制的平板培養(yǎng)基。
 
3.  轉(zhuǎn)化后的菌落全為藍(lán)色 (或淡藍(lán)色)，為什么?
 
插入的PCR片段較短（小于500 bp)，且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框時，平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍(lán)色。
 
4.  插入的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序時，可使用何種引物?
 
本制品的載體來源于pUC18載體。因此，用于pUC18載體測序的引物都可以使用。