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實(shí)驗(yàn)方法原理 針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆基因組中被導(dǎo)入的35S啟動(dòng)子、NOS終止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因，自行設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，采用雙重PCR同時(shí)擴(kuò)增上述基因，用8g/L羥丙基甲基纖維素為篩分介質(zhì)，在50cm×100μm i．d．涂壁毛細(xì)管中，于一10kV電壓下用激光誘導(dǎo)熒光-毛細(xì)管電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)材料 陽性抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆樣品非轉(zhuǎn)基因大豆寡核苷酸引物
試劑、試劑盒 溴乙錠羥丙基甲基纖維素三羥甲基氨基甲烷Sulforhdamine B三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸硼酸Taq DNA 聚合酶dNTPspUC19DNA Msp I(HpaⅡ)Marker
儀器、耗材 毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)裝置石英毛細(xì)管UNO 型PCR儀PAC3000型電泳儀UVI紫外成像分析儀
實(shí)驗(yàn)步驟 
1.總DNA提取

用CTAB法提取植物總DNA.

2.PCR體系及反應(yīng)條件

雙重PCR反應(yīng)體系：1×buffer,2.5mmol/L MgC12,0.25mmol/L dNTP,primers（0.4 μmol/L ZY1-35S,ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS,ZY4-NOS），1.5units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA100——200ng,總反應(yīng)體積25μ1.PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性3min;95℃ 45s,55℃ 60s,72℃ 45s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min.

內(nèi)源基因（Lectin）的PCR 反應(yīng)體系：1×buffer,2.0mmol/L MgC12,0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L primers.1.0 units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA1O0——200ng,總反應(yīng)體積25μ1.PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性3min;95℃ 45s,58℃ 60s,72℃ 45s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min.

3.PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳 在電泳分析前，先將毛細(xì)管柱填充1g/L HPMC,再充以含有3.75μmol/L溴乙錠的8g/L HPMC,電泳分離的緩沖溶液為TBE溶液（45mmol/L Tris,45mmol/L boric acid,1 mmol/L EDTA,pH 8.5）。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1Oμl加入內(nèi)標(biāo)2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl,在-1OkV下電動(dòng)進(jìn)樣20 s,并在-1OkV下恒壓電泳，用543.5nm 波長(zhǎng)的激光激發(fā)DNA段與溴乙錠的結(jié)合物產(chǎn)生熒光，在590nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。電泳溫度為20℃。每次電泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液沖洗毛細(xì)管5min,再進(jìn)行下一次檢測(cè)。pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）Marker用作DNA marker,使用時(shí)Maker用適量無菌水稀釋。電泳圖譜和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用C++語言編制的windows軟件進(jìn)行采集和分析處理。

4.PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 將5μl PCR產(chǎn)物與1μl上樣buffer混合后上樣于30g/L瓊脂糖凝膠中（含0.1μg/ml溴化乙錠）。在0.5×TBE電泳緩沖液中，于100V電壓下，電泳50min,采用pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）DNA Marker同時(shí)電泳，然后用UVI紫外成像分析儀觀察結(jié)果。

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注意事項(xiàng) 
1.內(nèi)徑為100μm的毛細(xì)管對(duì)DNA 片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pUC19DNA/Msp I（Hpa Ⅱ）Marker 中的110（111）/147 bp DNA 片段的分離度可達(dá)2.91,而且內(nèi)徑為100μm的毛細(xì)管柱檢測(cè)光程較大，因而較內(nèi)徑為50μm和75μm的毛細(xì)管柱的檢測(cè)靈敏度高。采用內(nèi)徑為100μm的毛細(xì)管柱，減少其長(zhǎng)度至40cm,對(duì)110（111）/147bp標(biāo)準(zhǔn)DNA段的分離度減少至2.13.因此本實(shí)驗(yàn)選用50cm×100μm i.d.的毛細(xì)管進(jìn)行電泳分離。

2.隨著纖維素質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DNA段的分離能力越好，當(dāng)膠質(zhì)量濃度達(dá)到8g/L時(shí)，110/147bpDNA段的分離度大（R=2.91）。繼續(xù)增加膠的質(zhì)量濃度，分離度變化不大，但篩分介質(zhì)的粘度增大，分析時(shí)間延長(zhǎng)。故本實(shí)驗(yàn)選用HPMC為8g/L.

3.不同大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)片段的遷移時(shí)間均隨場(chǎng)強(qiáng)的升高而減小。對(duì)于147bp DNA段，柱效的考察結(jié)果顯示，在場(chǎng)強(qiáng)為150V/cm——200V/cm 時(shí)具有高理論塔板數(shù)2.3×1O0000.當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度高于200V/cm時(shí)，遷移時(shí)間變短，但焦耳熱效應(yīng)也較為顯著，從而引起譜帶的展寬，在一定程度上降低了柱效，使分離度降低。為了進(jìn)行快速分離，我們選用在較高的場(chǎng)強(qiáng)200V/cm下進(jìn)行電泳分析。

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其他 
1.遷移時(shí)間的重現(xiàn)性

DNA段遷移時(shí)間的重現(xiàn)性是基因分析中的重要指標(biāo)之一。我們對(duì)DAN片段遷移時(shí)間的重現(xiàn)性進(jìn)行了考察，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)所用的DNA相對(duì)分子質(zhì)量marker和PCR產(chǎn)物連續(xù)分析6次，并在待測(cè)試樣中加入Sulforhdamine B熒光試劑作為內(nèi)標(biāo)物，采用相對(duì)遷移時(shí)間以消除進(jìn)樣時(shí)間和電壓的波動(dòng)對(duì)遷移時(shí)間的影響。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條

件下，對(duì)所用的DNA marker分析具有很好的重現(xiàn)性，相對(duì)遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.90——1.5.對(duì)進(jìn)口大豆的雙重PCR產(chǎn)物重復(fù)測(cè)定，其中125bp和142bp DNA段相對(duì)遷移時(shí)間分別是0.504和0.526,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.O——3.2 .

2.毛細(xì)管電泳與瓊脂糖凝膠電泳的比較

將陽性抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)、空白對(duì)照和進(jìn)口大豆的雙重PCR產(chǎn)物以及陰性非轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因PCR產(chǎn)物同時(shí)用毛細(xì)管電泳和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)，傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，進(jìn)口大豆和陽性對(duì)照的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)均擴(kuò)增出2個(gè)條帶，分別為125 bp和142 bp;作為陰性對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因大豆僅能擴(kuò)增出內(nèi)源基因的118 bp條帶;用無菌水作模板的空白對(duì)照不能擴(kuò)增出任何條帶。比較瓊脂糖凝膠電泳與毛細(xì)管電泳的結(jié)果，兩者基本一致。

毛細(xì)管電泳采用上萬伏的高電壓，能更有效地分離差異較小的片段。并能在較短的時(shí)間內(nèi)完成分析。本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)DNA段在15 min內(nèi)就可被分離，縮短了分析時(shí)問。而瓊脂糖凝膠電泳分離上述兩個(gè)片段需要50min.可見，同瓊脂糖凝膠電泳相比，毛細(xì)管電泳分析速度更快 毛細(xì)管電泳所需的樣品量少。本實(shí)驗(yàn)采用電動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量約5nl,而瓊脂糖凝膠電泳需要5——10μl的上樣量 所以用毛細(xì)管進(jìn)行分析，可以大大節(jié)約樣品用量，適合于痕量分析。

凝膠電泳圖譜的條帶一般較寬，不利于DNA段大小的確定。而毛細(xì)管電泳柱效高。峰形尖銳，鑒定能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)與樣品同時(shí)電泳，可減少進(jìn)樣時(shí)間和電壓的波動(dòng)等造成的實(shí)驗(yàn)誤差，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)DNA Marker和樣品毛細(xì)管電泳圖譜，可得DNA段大小分別為124 bp和145 bp,與測(cè)序結(jié)果相比較。分別差1 bp和3 hp;圖中峰的DNA段大小為121bp,與文獻(xiàn)報(bào)道的片段大小相比僅差3 bp.由此可見。用毛細(xì)管電泳比用凝膠電泳確定DNA段大小更為準(zhǔn)確。

綜上所述，本研究利用雙重PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增抗草甘瞵轉(zhuǎn)基因大豆的3種外澡靶基因，只需一次PCR反應(yīng)就可以準(zhǔn)確鑒定出抗草甘膦大豆 采用激光誘導(dǎo)熒光-毛細(xì)管電泳分析PCR產(chǎn)物，較傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電罰：相比，縮短了分析時(shí)間，分析靈敏度顯著提高，而且樣品用量少 本研究所建立的方法為食品中轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)提供了一個(gè)可靠的分析手段。