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產(chǎn)品及特點(diǎn) 奧葉茲基氏病病毒(Aujeszky’s Disease Virus，ADV) 是引起牛、羊、豬、犬
和貓等多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒。
由于本病的臨床癥狀類似狂犬病，臨床表現(xiàn)為*的恐水、怕風(fēng)、咽肌痙攣、進(jìn)行性癱
瘓等，也有“偽狂犬病”這一病名，對(duì)人體健康具有重要影響，因此奧葉茲基氏病病毒
的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的奧葉
茲基氏病病毒染料法熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)奧葉茲基氏病病毒保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于
不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，
本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)
照。
2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得
1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分
震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），
一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照的第 4
號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝）或第 5 號(hào)（濃度為 1×10E5
拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求
的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，
則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼
容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。本
試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次一管式病毒 DNAout

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)
樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù)，則
反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢
后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：
成分
樣品管
N+2 個(gè)
PCR 陰性
對(duì)照管
PCR 陽(yáng)性
對(duì)照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix
（棕色管）
10 μL 10 μL 各 10 μL
奧葉茲基氏病病毒 PCR
引物混合液（白蓋）
2 μL 2 μL 各 2 μL
自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 待測(cè)樣品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
第 7 步所得 PCR 陽(yáng)性對(duì)照
稀釋液（2-7 號(hào)）
不加 不加
各 6μL（2 號(hào)樣到
2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3
號(hào)管…）
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀
器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行
優(yōu)化）。
過(guò)程 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 92℃ 5 分鐘
PCR 反應(yīng) 92℃ 60 秒
（30 個(gè)循環(huán)） 58℃ 60 秒
74℃ 60 秒
13. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)，
大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光
譜在 530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱
軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的
log 值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等
于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于
30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為
陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則
為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。
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