用途 犬細小病毒（CPV）的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試驗用于犬血清、糞便和腸道、心臟、肺臟 等組織中的 CPV，，適用于 CPV 的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

原理 提取病料 DNA 作為模板，高溫使模板的一條雙鏈 DNA 變性后形成兩條單鏈，低溫使引物與

互補的模板形成雙鏈，中溫時，在 TaqDNA 聚合酶作用下，以 dNTP 為原料，以引物為復(fù)制的起點，沿 模板合成一條新鏈。每個循環(huán)包括：高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個過程。每一次循環(huán)使擴增的 DNA 段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35 次循環(huán)，使擴增的 DNA 段放大了數(shù)百萬倍。將擴增產(chǎn)物進行電 泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA 段的擴增帶。

試劑盒組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 6 個月。

需要自備的物品

1．儀器：分析天平、水浴鍋、離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分 析儀）、微波爐、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。 2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL 一次性注射器、1.5 mL 滅菌離心管、瓊脂糖、500 mL 量筒、500 mL 錐形瓶、吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。

注意事項

1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室。

2．PCR  整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴 增區(qū)→電泳區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。

3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃。

4． 消化液低溫時可能出現(xiàn)結(jié)晶，請于 37 ℃溫育，溶解至澄清透明后使用。

5． 染色液低毒，操作時應(yīng)戴上手套，避光保存，較長時間不使用請存放于 4℃，以免揮發(fā)變干。 染色液和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。

6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

7．嚴格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須。

8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。

樣品制備

1 樣品采集：病死犬，取腦、心臟、肺臟等組織病變部與健康部交界處組織；待檢病犬，用棉拭子 取排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中或者將糞便取到無菌的小青瓶中；待檢病犬，用注射器取血 2mL。 2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復(fù)凍融病料。）

2  樣品處理：每份樣品分別處理。

2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，

振蕩混勻后，置 56    ℃水浴中消化 1 小時。

2.2 排泄物的處理：將排泄物振蕩混勻或取糞便約 0.05 g 到離心管中加入 1.5 mL 生理鹽水振蕩混勻，

8000 rpm 離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋

白酶 K，振蕩混勻后，置 56    ℃水浴中消化 1 小時。

2.3  全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，

置 56    ℃水浴中消化 1 小時。

2.4 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56    ℃

水浴中消化 1 小時。

2.5 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56    ℃

水浴中消化 1 小時。

操作步驟

1 病毒 DNA 的提取

1.1 從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入 300 μL DNA 結(jié)合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸 附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），室溫 靜置 3 min，10000 rpm 離心 30 s。

1.2  棄去收集管中液體，加入 500 μL DNA 洗滌液，10000 rpm 離心 30 s。

1.3 重復(fù)步驟 1.2。

1.4  棄去收集管中液體，10000 rpm 空柱離心 1 min，以除去殘留的 DNA 洗滌液。

1.5 將吸附柱放入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入 DNA 洗脫液（ 56 ℃預(yù)熱）50 μL，室溫 放置 2 min，10000 rpm 離心 30 s，離心管中液體即為模板 DNA。

2 PCR 擴增

每份總體積 20 µL，含 16 µL PCR 反應(yīng)液（用前混勻），2 µL Taq DNA 聚合酶，2 µL 模板 DNA。 例如：n 份樣品，配制 n+1 份，16×（n+1）PCR 反應(yīng)液，再加入 2×（n+1）Taq DNA 聚合酶，

混勻后取 18 µL 分裝成 n 份，分別加入 2 µL 模板 DNA，加入 20 µL 礦物油覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴 增儀不用加），作好標記。

在 PCR 擴增儀上進行以下程序：95℃ 3min；循環(huán) 94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30S，共 35 次； 再 72 ℃延伸 10min。

3 電泳

稱 3g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍 TAE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL），于微波爐中熔解，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳 槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR 擴增產(chǎn)物 10 µL，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以 110～ 120 V 電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

結(jié)果判定 陽性對照出現(xiàn) 420bp 擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。 被檢樣品出現(xiàn) 420bp 擴增帶為 CPV 陽性，否則為陰性。