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主要用途
組織樣品細(xì)胞色素c氧化酶活性測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)細(xì)胞色素c氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中還原性細(xì)胞色素c氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織（動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等）裂解懸液中細(xì)胞色素c氧化酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景
細(xì)胞色素c氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，主要通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量?；诘孜镞€原型細(xì)胞色素c（reduced cytochrome c），受到細(xì)胞色素c氧化酶的催化，轉(zhuǎn)化為氧化型細(xì)胞色素c（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現(xiàn)吸光值的變化（550nm 波長(zhǎng)），由此定量測(cè)定細(xì)胞色素c氧化酶的活性。細(xì)胞色素c氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容
 清理液（Reagent A）          60毫升
 裂解液（Reagent B）          10毫升
 緩沖液（Reagent C）          20毫升
 反應(yīng)液（Reagent D）           2毫升
 稀釋液（Reagent E）          1毫升
 穩(wěn)定液A（Reagent F1）          1管
 穩(wěn)定液B（Reagent F2）        250微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)            1份

保存方式
保存清理液（Reagent A）、 緩沖液（Reagent C）和 稀釋液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備
1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液和樣品制備的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品準(zhǔn)備
1．手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量
2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3．（選擇步驟）加入適量的（500毫克組織需要3毫升） 清理液（Reagent A）清洗1次
4．移入到一個(gè)液氮凍存管
5．即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
6．次日從液氮罐里取出，即刻（z快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7．放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8．加入預(yù)冷的500微升 裂解液（Reagent B）
9．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
10．強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11．置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br />12．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM）
13．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
14．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用  考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒A045-2）
15．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、測(cè)讀準(zhǔn)備
1．準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里融化
2．設(shè)定好分光光度儀：溫度25℃，波長(zhǎng)550nm，間隔10秒，測(cè)讀7次（共60秒），并置零或設(shè)置0秒和60秒各測(cè)讀1次
3．實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 穩(wěn)定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出250微升到 穩(wěn)定液A（Reagent F1）管里，混勻后，標(biāo)記為 穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的 反應(yīng)液（Reagent D）置入冰槽里融化，然后移出100微升到新的1.5毫升離心管，加入3微升 穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置至少15分鐘（可見(jiàn)顏色變化），置于冰槽里，標(biāo)記為 反應(yīng)工作液（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)4），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作
4．緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對(duì)照測(cè)定
1．移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的1毫升比色皿
2．加入100微升 稀釋液（Reagent E）
3．上下傾倒數(shù)次，混勻
4．室溫下孵育3分鐘
5．放進(jìn)分光光度儀，置零
6．取出比色皿，加入100微升含有 反應(yīng)液（Reagent D）和 穩(wěn)定液（Reagent F）的 反應(yīng)工作液
7．上下傾倒數(shù)次，混勻
8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），正常讀數(shù)差值為0.001至0.005

四、樣品測(cè)定
1．移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入100微升待測(cè)樣品（注意：建議總量50微克總蛋白，且樣品需澄清）
3．上下傾倒數(shù)次，混勻
4．室溫下孵育3分鐘
5．放進(jìn)分光光度儀，置零
6．取出比色皿，加入100微升含有 反應(yīng)液（Reagent D）和 穩(wěn)定液（Reagent F）的 反應(yīng)工作液
7．即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），通?；钚宰x數(shù)差值為正數(shù)

五、計(jì)算樣品活性
【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）×1（體系容量；毫升）×樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1（樣品容量；毫升）×21.84（毫摩爾吸光系數(shù)×1（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾細(xì)胞色素c/分鐘

注意事項(xiàng)
1．本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
2．操作時(shí)，須戴手套
3．樣品制備中忌用DTT和巰基乙醇等處理
4．每增加1個(gè)樣品，增加 反應(yīng)工作液為： 反應(yīng)液（Reagent D）100微升＋ 穩(wěn)定工作液3微升，以此類(lèi)推。配制反應(yīng)工作液時(shí)，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實(shí)際工作液容量。
5．系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
6．分光光度計(jì)波長(zhǎng)嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號(hào)
7．加樣后3秒內(nèi)進(jìn)行比色測(cè)定
8．比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
9．比色皿背景空對(duì)照0秒讀數(shù)通常大于0.2為理想狀態(tài)；建議使用比色皿測(cè)定
10．背景空對(duì)照的正常讀數(shù)差值（0秒－60秒）通常為0.001至0.005（正負(fù)即可）
11．樣品0秒讀數(shù)通常和背景空對(duì)照0秒讀數(shù)一致
12．樣本測(cè)定60秒讀數(shù)低于0秒讀數(shù)表明具有酶活性
13．酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）氧化1微摩爾的細(xì)胞色素c
14．建議待測(cè)樣本總蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，即60秒讀數(shù)不變或?yàn)榱悖瑒t可以增加或降低樣本量（本公司提供考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒A045-2）