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上海雅吉生物科技有限公司
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細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法
2021-1-28 閱讀(388)
細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細(xì)胞核裂解成若干碎片，細(xì)胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹，胞漿內(nèi)形成多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody)。這不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、細(xì)胞崩解。
根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，至今為止，已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。
一、光學(xué)顯微鏡觀察
凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。
本方法簡便易行，但在細(xì)胞密集的組織中對于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強(qiáng)的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一。
檢測方法：細(xì)胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。
二、視頻時(shí)差顯微技術(shù)
此方法用于細(xì)胞培養(yǎng)，通過相差顯微鏡可動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細(xì)胞表和外形的變化。凋胞與基質(zhì)分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細(xì)胞拉長，出現(xiàn)釘狀突起，特續(xù)數(shù)小時(shí)后細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞溶解，通過連續(xù)觀察，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細(xì)胞，但不能用于病理組織。
檢測方法：收集2×105細(xì)胞/ml培胞，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導(dǎo)劑，在帶有自動(dòng)攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續(xù)24小時(shí)。如同進(jìn)進(jìn)行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。
三、電子顯微鏡觀察
雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時(shí)期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典、可靠的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。
缺點(diǎn)：
(1)只能定性,不能定量;
(2)標(biāo)本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標(biāo)本檢測;
(3)在組織切片上進(jìn)行電鏡觀察時(shí),有時(shí)凋亡很難與正常細(xì)胞有絲分裂相鑒別,因?yàn)閮煞N情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時(shí)進(jìn)行熒光染色,可彌補(bǔ)電鏡檢查的不足。
檢測方法：透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。
四、流式細(xì)胞技術(shù)
流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的。細(xì)胞穿過流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強(qiáng)度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性(granu-larity)有關(guān)。
細(xì)胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強(qiáng)或不變，前者反映了細(xì)胞的皺縮，后者反映了細(xì)胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細(xì)胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。
由于光散射牧場生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰(xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak),代表凋亡細(xì)胞。
根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細(xì)胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。
檢測方法：獲取密度1×106細(xì)胞/ml左右的細(xì)胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細(xì)胞儀分析。
