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DAPI配置方法
2022-6-14 閱讀(7944)
DAPI配置方法
DAPI是一種可與DNA的小溝結(jié)合的細胞滲透性熒光探針，它可與雙鏈DNA結(jié)合，發(fā)出藍色熒光，熒光強度是自身的20倍。瓊脂糖凝膠電泳DNA的染色中DAPI的染色效果是溴化乙淀的數(shù)倍。DAPI也能對RNA染色，染色機理是其可以選擇性嵌入“AU序列"并發(fā)出熒光。
DAPI常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。盡管DAPI不能通過活細胞膜，但卻能穿透擾亂的細胞膜而對核染色。DAPI具有很高的光漂白承受水平，能用來檢測酵母線粒體DNA，葉綠體DNA，病毒DNA，支原體DNA以及染色體DNA。
DAPI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)光為364nm，最大發(fā)射光為454nm。DAPI水溶液在349nm處和263nm處有吸收峰。它可以與熒光素二乙酸酯結(jié)合使用用于成熟花粉粒細胞核的活體染色。
使用方法：
1. 配制方法：用1mL ddH2O將DAPI溶解，制得2.9mM的DAPI溶液(1mg DAPI/1mL H2O)。取適量DAPI水溶液加到PBS或雙蒸水中，制備成10～50µM的DAPI工作液。
注：DAPI不能直接用PBS等緩沖溶液溶解，需要先用水將其溶解。
2. 使用濃度：0.5-10 μg/mL
3. 使用方法：
A：固定的細胞或組織染色：
1) 對于固定的細胞或組織樣品，固定后，適當(dāng)洗滌去除固定劑。DAPI染色通常在其他染色的最后進行。如果不需要進行其它染色，則直接進行DAPI 染色。
2) 對于貼壁細胞或組織切片：加入適量DAPI染色液，覆蓋住樣品即可。
3) 對于懸浮細胞：至少加入待測染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。
4) 吸除DAPI染色液，用TBST、PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。
5) 用帶有360nm激發(fā)波長，460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。
B：活細胞或組織染色：
1) 細胞培養(yǎng)物中加入適量DAPI染色液，約1/10細胞培養(yǎng)基體積，必須充分覆蓋住待染色的樣品。通常對于6孔板一個孔需加入1 mL染色液，對于96孔板一個孔需加入100 μL染色液。
2) 在 37℃培養(yǎng)細胞 10～20 分鐘。
3) 用 PBS或合適的緩沖液洗細胞兩次。
4) 用帶有360nm激發(fā)波長，460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。
儲存溫度：2-8℃干燥避光保存。
