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液體樣本甘油酶法測定試劑盒的原理
2023-11-30 閱讀(279)
液體樣本甘油酶法測定試劑盒的原理
描述：甘油是甘油三酯的水解產物。脂蛋白酯酶能夠水解血
液中的甘油三酯；胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯；激素
敏感脂肪分解酶能夠水解脂肪細胞中的甘油三酯。與游離脂
肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應的可靠檢測指標，
但檢測更加方便。本試劑盒采用甘油磷酸氧化酶法與經典的
GPO-Trinder 酶學反應方法，通過比色測定液體樣本中的甘
油含量。經過優(yōu)化后，操作步驟更加簡單，檢測線性范圍在
10-1200µmol/L，可靠性和重復性俱佳，適合生物醫(yī)學、食
品實驗室檢測。
原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，
再被甘油磷酸氧化酶氧化產生過氧化氫；在過氧化物酶作用
下生色底物轉化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正
比。
適用范圍：測定血液、細胞培養(yǎng)基、體液、酒類飲料中的甘
油濃度。
組成 ：（以 250 次為例）
(1) R1 試劑 40 ml
(2) R2 試劑 10 ml
(3) 4 mmol/L 甘油標準品 1 ml
4 oC 保存，6 個月有效
所需設備：酶標儀、生化分析儀或 721、722 型可見光分光
光度計。最佳工作波長 550nm，如無此波長建議優(yōu)先選用
570nm、次選 530、490nm。
一 樣本處理：
1. 酒類、飲品、清澈液體樣本：可直接進行測定，如超過
線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后再進行測定。
2. 培養(yǎng)液：取不含酚紅、無顏色、無血清的細胞培養(yǎng)基，
如有細胞碎片應 4oC,，12,000g 離心 5min,取上清進行測
定。
3. 血液：對于新鮮抗凝血而言，可 4oC，2,000g 離心 5min
得到血漿；而對于非抗凝血來說，可先 4oC 靜置 2h 得
到血清后，2000g 離心 10min,除去血細胞。將得到的血
漿/血清 70oC 加熱 10 分鐘滅活內源脂肪酶，12,000g
離心 10min ,去上清進行測定或-20oC 保存。
二 工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 試劑 R1 與 1 ml 試
劑 R2 混合即可，立即使用或 4oC 保存<1 天，變色棄去。
三 標準品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致
的液體，將 4 mM 甘油標準品倍比稀釋為 1000、500、
250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常
取其中 4~6 管即可，注意設置 0 濃度對照反應管。
四 甘油濃度測定：
1. 參見下表進行加樣。為使反應時間盡量一致，減小實驗
誤差，可先加入標準品、待測樣品，然后再加入工作溶
液。（注意：當甘油濃度較低時，可將待測樣品與工作
溶液按照 100µl:100µl 體積進行混合，然后再進行測定，
但是如果樣品體積超過 100µl 時將會稀釋工作液中酶
的濃度，致使反應靈敏度下降。如果待測樣品濃度超過
線性范圍的時候，可進行適當稀釋，然后根據稀釋倍數
來計算樣品中甘油濃度。）
2. 37oC 或 25oC 反應 15 分鐘。反應平衡后顏色在 60 分鐘
內穩(wěn)定。
3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調零，然后測定各管 OD
值。
4. 繪制標準曲線并計算甘油濃度。
附 Excel 作圖步驟：各標準管 OD 值為 y 軸，標準品濃
度為 x 軸。(1)鼠標左鍵圈住數據，點擊做圖向導，選
擇-散點圖-，點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一
點，點擊-添加趨勢線-，點擊-選項-，點擊-顯示公式-
和-R 2值-。
表一：
酶標微板測定的加樣比例（檢測范圍 10-1200µmol/L）
（可對樣品和工作液比例進行微量調整）
液體樣本甘油酶法測定試劑盒的原理
