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南京億迅生物科技有限公司
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免疫組化 IHC-P 實(shí)驗(yàn)方案分享
2024-7-4 閱讀(474)
免疫組化 IHC-P 實(shí)驗(yàn)方案分享（僅供參考）
1.脫蠟和水化，時(shí)間由二甲ben新鮮程度和室溫等綜合決定
2.抗原修復(fù)，修復(fù)強(qiáng)度：高壓修復(fù)>微波修復(fù)>胰-酶修復(fù)；修復(fù)液多種，EDTA>檸檬酸；85~95℃處理約15min，自然冷卻至室溫
3.細(xì)胞通透，TritonX-100, >10 um厚切片
4.滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生-物-素，3% H2O2 10~12min
5.血清封閉，小牛血清、BSA、羊血清, 不能與一抗來源一致
6.抗體孵育，濃度最重要，溫度決定反應(yīng)速度，時(shí)間決定反應(yīng)量
7.--- 4℃過夜(16~24h)，次日37 ℃復(fù)溫 30 min，反應(yīng)溫和，背景淺
8.--- 37 ℃ (1-2 h)，反應(yīng)速度快，時(shí)間短
9.--- 室溫，無法保證每次環(huán)境溫度控制在一定范圍，不建議
10.抗體稀釋液(PBS, 專用的, PH7.4)
11.切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗，普通5 min*3 ，抗體10min*4)
12.DAB顯色，由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，決定背景的深淺和特異性染色的深淺
13.復(fù)染，目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，胞漿蛋白適當(dāng)時(shí)間長一點(diǎn)，核蛋白則要短。
14.長期保存，高倍鏡觀察，需脫水透化
15.封片，中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡
16.免疫熒光注意避光，防止熒光衰減淬滅，防止自發(fā)熒光現(xiàn)象
