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BBT緩沖液（PH7.4)

相關(guān)實(shí)驗(yàn)僅供參考

1、材料與試劑

（1）pH7.4 BBT緩沖液

氯化鈉85.00g

BBT5.75g

BBT鈉3.75g

氯化鎂（MgCl2·6H2O）1.88g

氯化鈣0.28g

H2O加至2000ml

配制時，先將BBT溶于500ml水中，然后加入氯化鈉和BBT鈉，加水至2000ml，最后加入氯化鎂和氯化鈣。高壓滅菌后，置4℃保存，此為原液。應(yīng)用時，以蒸餾水作1：5稀釋，配成使用液，并測定使用液的pH值。如pH值過高則以BBT調(diào)節(jié)，過低則以BBT鈉調(diào)節(jié)；

（2）1％瓊脂糖 以0.10%疊氮鈉防腐；

（3）綿羊紅細(xì)胞；

（4）溶血素 要求效價在1.0×104倍以上；

（5）乙腦病毒P3株 其對小白鼠（8g～10g體重）的MLD（腦內(nèi)）為1.00×10-9/0.03ml；

（6）抗乙腦病毒抗體 是采用地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的乙腦病毒物多次腹腔接種豚鼠而獲得，補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)效價達(dá)256×以上為合格。應(yīng)用前，需加入1/10量的新鮮補(bǔ)體液，37℃水浴感作1h，然后56℃感作30min以滅活補(bǔ)體。此過程是除去豚鼠血清中的抗補(bǔ)體成分；

（7）正常豚鼠血清；

（8）塑料瓊脂擴(kuò)散板 板長7.20cm，寬2.50cm，高0.20cm。

2、操作方法

（1）綿羊細(xì)胞的致敏 取效價1.00×104倍以上的溶血素，以pH7.2的BBT緩沖液做100倍稀釋，同時加入已洗滌好的綿羊紅細(xì)胞泥，配制成40%左右（V/V）的紅血球，充分混合后，置37℃水浴感作30min，其間振蕩2～3次。然后4℃保存。這種致敏紅細(xì)胞可在4℃內(nèi)保持一周有效；

（2）固相致敏血球板的制備 將以上致敏紅細(xì)胞懸液37℃水浴預(yù)熱后，吸取0.1ml，加入已融化好并冷卻至50℃～55℃的1%瓊脂糖（3ml）管中，迅速傾倒混合均勻，并傾入塑料瓊脂擴(kuò)散板中，自然冷卻后加蓋，4℃保存。此板可保存2周；

（3）敏感試驗(yàn) 每批固相致敏血球板制好后，必須進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。選其中一板，在瓊脂上打孔，直徑6mm，滴入以生理鹽水稀釋的3倍的補(bǔ)體（豚鼠血清），蓋上蓋，放入37℃溫箱中1h后取出觀察，應(yīng)出現(xiàn)溶血圈。放置4h后溶血圈的直徑達(dá)8mm以上者為合格固相致敏板；

（4）打孔 用直徑6mm的打孔器在瓊脂板上打孔兩排，上下排各4個。同時在右上角打一小孔，以作為方位記號；

（5）樣品處理 將乙腦感染的鼠腦和健康正常的鼠腦分別用生理鹽水于研磨器研磨成均勻的10×稀釋的乳劑，以3000r／min離心20min，吸取上層液供檢驗(yàn)用；

（6）樣品預(yù)處理 在小管中滴加等量的（如1～2滴）10×稀釋的腦乳劑離心上清液，免疫血清和補(bǔ)體，充分混合，置37℃感作2h～6h。同時用陰性血清同樣處理；

（7）加樣 每個樣品加兩個孔，上孔加陰性血清處理的樣品，下孔加陽性血清處理的樣品，加樣必須一致，以加滿為度；

（8）擴(kuò)散 加畢后加蓋，置37℃擴(kuò)散，并隨時觀察記錄結(jié)果。

3、結(jié)果判定

37℃溫箱感作1.5h～2h后初判，首先看上排孔，此時都已出現(xiàn)清晰但較窄的溶血圈。隨即觀察下排孔，有不出現(xiàn)溶血圈者即判為陽性，也出現(xiàn)溶血圈者（可能比上孔的溶血圈稍窄），判定為陰性。如果反應(yīng)不清晰，可在滴樣后4h再作一次終判。此時溶血圈較寬，故可測量同一病料上孔與下孔的溶血圈直徑之差。以相差1.5mm以上者為陽性，相差1mm～1.5mm者為可疑，相差1mm及以下者為陰性。溶血圈中溶血不*時扣0.5mm，例如溶血圈直徑為7mm，但溶血不*，則以6.5mm計(jì)算。 

當(dāng)初判與終判結(jié)果發(fā)生矛盾時，以初判為準(zhǔn)。

為便于觀察和測量溶血圈，可在致敏血球板下置一白紙，距離20cm左右，判定時由上向下觀

BBT緩沖液（PH7.4)