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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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液質聯用進行菠菜中殘留農藥檢測
2023-2-19 閱讀(111)
摘要本應用方法介紹了一種簡單、快捷、廉價、有效、耐用、安全的(QuEChERS) EN 樣品制備方法及其應用，該方法可用于菠菜中 13 種具代表性的不同種類殘留農藥的萃取和凈化。菠菜被認為是一種高色素基質，而用于高色素瓜果和蔬菜的 EN 分散固相萃取試劑盒是有選擇性的。試劑盒中將添加了 7.5 mg/mL 石墨化碳黑（GCB）的乙腈萃取劑。通過液相色譜和電噴離子化串聯質譜儀聯用（LC-ESI-MS/MS），正離子模式多重反應監(jiān)測模式（MRM）測定菠菜萃取物中的殘留農藥。通常認為 GCB 對平面結構的農藥萃取有顯著的負影響。但是，本文研究結果顯示在 EN 分散固相萃取試劑盒中添加少量 GCB 時對平面結構農藥的影響可以忽略，所得定量結果也是可以接受。本指南給出的菠菜中農藥的定量限（LOQ）為 5 ng/g，大大低于最高允許殘留（MRL）?；厥赵囼灥募訕怂椒謩e為 10、20、200 ng/g，表明回收率在 60%-99%范圍內（平均 85.4%），相對標準偏差低于11%（平均 5.5%）。
引言EN QuEChERS 方法被廣泛的用于食品中的農藥分析，特別是在歐洲。該方法采用乙腈作萃取劑，然后通過利用氯化鈉和檸檬酸鹽緩沖液從樣品中的鹽析出水來誘導液-液分層。為了凈化的需要，采用了分散固相萃取步驟，結合乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)的使用以除去脂肪酸及其它組分，則用來吸收萃取物中的殘留水。根據不同的食物基質，該步驟中可能會增加其它成分，如用于除去色素和甾醇的石墨化炭黑（GCB）或者用于除去更多類脂和脂肪油的 C18 等。由于含有高濃度的葉綠素，菠菜被認為是一種高色素蔬菜。因此，本應用選用適用于高色素量商品的 EN 分散固相萃取試劑盒。在這些試劑盒中，除了 25 毫克 PSA 和 150 毫克 MgSO4 外，每毫升乙腈萃取劑中還加入了 7.5 毫克 GCB。GCB 可以吸附平面分子如色素和甾醇，因此它對于凈化色素基質如菠菜是非常有幫助的。GCB 添加量越大，平面分子吸收得越多，可得到更干凈基質的樣品。EN 法和 AOAC 法在凈化高色素基質方面的主要區(qū)別是在分散固相萃取步驟中 GCB 添加量不同是。AOAC 法中 GCB 的添加量較高（每毫升乙腈萃取劑中添加 5 毫克 GCB），EN 法中 GCB的添加量較低 (處理“有色"產品時，每毫升乙腈萃取劑中添加2.5 毫克 GCB；處理“深色"產品時，每毫升乙腈萃取劑中添加7.5 毫克 GCB)。GCB 對平面農藥萃取的影響隨所用方法的不同而有所區(qū)別。AOAC 法可制得基質更干凈的樣品，但是易造成平面農藥分子的大量損失；與此相反，EN 法造成的平面農藥分子損失較少，但樣品基質更為復雜。
之前，我們曾介紹過一種改進的 AOAC 法，即在分散固相萃取中添加甲苯可明顯提高高色素基質（如菠菜）中平面結構農藥的萃取效率[3]。隨后，我們采用原始 AOAC 法（不含甲苯）和改進的AOAC 法（添加甲苯）相結合闡明了 Bond Elut QuEChERS AOAC試劑盒在菠菜中農藥殘留分析方面的性能[4, 5]。在這項研究中，采用 13 種農藥評價了安捷倫 EN 緩沖萃取劑(部件號 5982 - 5650)和Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取試劑盒在高色素水果和蔬菜(部件號 5982-5321 和 5982-5356)分析中的性能。也驗證了該方法的重現性和回收率也。表 1 是菠菜中各種農藥的化學和法規(guī)信息。
實驗部分藥品和試劑所用試劑和溶劑均為高效液相純級或分析純級。甲醇和甲苯購自霍尼韋爾（美國，馬斯基根）。乙腈(ACN)、二甲基亞砜(DMSO)、冰醋酸(HAc)購自 Sigma- Aldrich 公司（美國，密蘇里州圣路易斯）。醋酸銨(NH4OAc)購自費舍爾化工(美國，新澤西，Fair Lawn)。甲酸(FA)購自 Fluka(德國，Sleinheim)。農藥標準品和內標物（磷酸三苯酯，TPP）分別購自 Sigma- Aldrich 公司（美國密蘇里州圣路易斯）、Chem Service 公司（美國賓夕法尼亞州西切斯特）、Ultra Scientific 公司（美國羅得島州北金斯敦）或 AlfaAesar (美國，馬薩諸塞州，Ward Hill)。溶液及標準品將 19.27 克 NH4OAc 粉末溶解在 250 mLMilli-Q 超純水中，用 PH計監(jiān)控，采用乙酸調溶液 PH 值到 5，得到 PH=5 的 1M 醋酸銨原液，并于 4 oC 保存。將 200mL MeOH 與 800mL Milli-Q 超純水混合，加入 5mL PH=5 的 1M 醋酸銨原液，混合均勻，得到MeOH/H2O=20：80、PH=5 的 5 mM 醋酸銨溶液。向 1L 乙腈中加入 5mLPH=5 的 1 M 醋酸銨原液，均勻混合后超聲 5 min，即得5 mM 醋酸銨乙腈溶液。1%甲酸的乙腈溶液可通過 100 mL 乙腈與1 mL 甲酸混合均勻得到。標準品和內標物（IS）儲備液(除多菌靈為 0.5 mg/ mL 外，其余均為 2.0 mg/ mL)分別用 MeOH，含 0.1 %甲酸溶液的乙腈或 DMSO配制，于-20 oC 下低溫儲存。1、5、20 µg/mL 的三種 QC 加標溶液以乙腈和 0.1%甲酸溶液的水 1:1 混合作基質，現配現用。制備10 µg/mL 標準品的乙腈/水（含 0.1% FA）=1:1 的加標溶液，并通過適當稀釋，用于獲得空白基質加標標準曲線。以含 0.1%甲酸溶液的 1:1 乙腈/H2O 為溶劑，制備 15 µg/mL 的 TPP 加標溶液。
儀器和材料Agilent 1200 Series HPLC with Diode Array Detector (AgilentTechnologies Inc., CA, USA)配備二極管陣列檢測器的 Agilent 1200 系列高效液相色譜系統(tǒng)（美國，加州，安捷倫科技有限公司）配置電噴霧離子源的 Agilent 6410 三重串聯四級桿 LC / MS 系統(tǒng)（美國，加州，安捷倫科技有限公司）Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取試劑盒，部件號 5982-5650和用于高色素水果和蔬菜的 Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取試劑盒，部件號 5982 - 5321 和 5982- 5356（安捷倫科技有限公司，德州，美國)CentraCL3R 離心機（美國馬薩諸塞州 Thermo IEC）瓶口移液器（美國新澤西州，So Painfield，VWR）Eppendorf 微型離心機（美國紐約，Westbury，Brinkmann 儀器公司）
儀器條件LC/MS/MS 法如前所述[9]液相色譜條件色譜柱： Agilent ZORBAX 溶劑節(jié)省 Plus Eclipse Plus苯基-己基柱，3.0 x 150 mm, 3.5 µm（部件號 959963-312)流速： 0.3 mL/min柱溫： 30 oC進樣量： 10 µL流動相： A, PH=5 的 5 mM 乙酸銨 MeOH/H2O=20:80 溶液；B, PH=5 的 5mM 乙酸銨乙腈溶液洗針液： 1:1:1:1 乙腈/甲醇/異丙醇/水含 0.2%甲酸梯度： 流速時間 % 乙腈 (mL/min)0 20 0.30.5 20 0.38.0 100 0.310.0 100 0.313.0 停止后運行： 4 分鐘總分析時間： 17 分鐘質譜條件正離子模式氣體溫度： 350 oC氣體流速： 10 升/分霧化氣： 40 Psi毛細管電壓： 4000V分析物相關的其他條件列于表 2。
樣品制備樣品制備過程包括樣品粉碎，萃取/分離和分散固相萃取凈化等步驟，這在早期的應用指南上有詳細的描述。[9]菠菜樣品處理過程與蘋果樣品處理過程很相似，但與一般的水果和蔬菜樣品處理相比，菠菜樣品處理的分散固相萃試劑盒適用于高色素量產品分析。簡單來說，首先將凍存的有機菠菜勻漿。取 10 克（±0.1 克）勻漿后的樣品放入 50 毫升離心管中。如需要，可先通過適當的QC 加標溶液(100 µL)對樣品進行加標，然后加入 66.7 µL IS 加標溶液（15 µg/mL 的 TPP）。渦旋 30 秒，每個樣品管中加 10 mL 乙腈，蓋緊樣品管蓋，振搖 1 分鐘。每一個離心管中直接加入Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取鹽包(部件號 5982-5650)、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉，0.5 g 檸檬酸氫鈉半水合物。蓋好管，用力振搖 1 分鐘，于 4000 rpm 離心 5 分鐘。1 mL 上層乙腈層轉入安捷倫分散型固相萃取柱的 2 mL 管中（部件號 5982-5321）；或 6 mL 上清液轉入安捷倫分散型固相萃取柱的 15 mL 管中（部件號 5982-5356 ）。2 mL 的管中含有 25 mgPSA， 7.5 mg GCB，而 15 mL 管中則含有150 mg PSA， 45 mg GCB。蓋緊管，用力搖 1 分鐘。將 2 mL 管 放入微 型離心 機中 13000 rpm 離心2 min，15 mL 管在標準離心機以 4000 rpm 離心 5 min。取 200 µL等份的萃取液轉移到進樣瓶中，立即加入 10 µL 1% 甲酸的乙腈溶液。然后加入 800 µL 水或者適量的標準品溶液（制備成水溶液）。蓋緊樣品管，渦旋混勻，以備 LC/MS/MS 分
結果與討論QuEChERS 方法為農藥殘留分析提供了獲得高質量結果的快速、簡便而廉價的方法。對于含色素的水果和蔬菜，在分散型固相萃取管中添加石墨化碳黑（GCB）可以提高色素和甾醇的清除效率。清除效率與 GCB 的加入量有關。添加 GCB 的量越多，處理后的基質就會越干凈，最終樣品中的基質干擾就越少。由于 GCB 也可能導致萃取過程中的平面結構農藥分子的清除，所以在 EN 分散固相萃取步驟中使用了非常少量的 GCB。與 AOAC 方法相比，用于色素性物質的 EN 方法在分散固相萃取步驟中使用了非常少量的 GCB。對于像胡蘿卜、生菜這樣的普通色素性商品，每毫升乙腈萃取劑中添加 2.5 mg 的 GCB；對于高色素性商品如菠菜和紅甜椒，每毫升乙腈萃取劑中則需要添加 7.5 mg 的 GCB。[1]根據建議，我們研究中采用適用于高色素產品的 EN 分散萃取試劑盒。由于采用高色素試劑盒，EN 方法中的 GCB 用量仍然比AOAC 方法低得多，每 mL 乙腈萃取劑中只需添加 50 mg GCB。所以，很明顯，EN 方法中的基質凈化效率要比 AOAC 法弱得多。通過 EN 方法處理得到的樣品仍然呈現深綠色，而先前經過AOAC 法處理后的樣品幾乎呈無色透明狀?？瞻谆|的紫外色譜（l= 254 nm）也有差異，如圖 1 所示。EN 法處理的空白基質中干擾峰更多，而且更多的雜質在色譜柱或離子源處累積，可能對色譜柱及質譜儀造成不利影響。然而，由于 LC/MS/MS 提供了選擇性，空白基質的 MRM 色譜圖并沒有顯示任何目標分析物的干擾峰。圖 2 顯示了空白基質（添加內標物）和 50 ng/g 經過 EN 分散萃取法處理的加標菠菜萃取物的 LC/MS/MS 色譜圖。4 種農藥包括多菌靈、噻菌靈、嘧菌環(huán)胺和吡蚜酮，由于具有平面結構，在經過原來的 AOAC 分散固相萃取方法處理時明顯損失。而在固相萃取步驟中，添加甲苯改進該方法可以提高萃取效率[3,4]。為了研究 GCB 對于平面結構農藥的影響，我們比較了固相萃取步驟中分別添加和不添加甲苯時，對相同農藥標準品（50ng/g）水平加標的菠菜樣品萃取效果。結果表明，在 EN 法中GCB 的使用量比較少時，平面農藥很少或沒有損失，加入甲苯沒有明顯改善。因此，后續(xù)實驗采用了原始的 EN 方法。也考察了該方法的回收率和重現性，還對定量結果進行了討論。
