熒光染色是分子生物學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。今天，我們來(lái)淺談熒光染色的一些基本實(shí)驗(yàn)步驟。這里以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中普通熒光染色為主，展開(kāi)對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟的介紹。

對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)常用的儀器主要有普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡。因此，一般需要準(zhǔn)備爬片或者是激光共聚焦培養(yǎng)皿。

爬片：是一種經(jīng)過(guò)特殊表面處理的玻片，常用的一般是24孔板配套的14mm直徑圓形玻片。除此之外還有6孔板，12孔板，48孔板等不同規(guī)格的爬片。經(jīng)過(guò)特殊處理的爬片可以讓細(xì)胞很好地黏附，但遇到粘附性極差地細(xì)胞，要保證它們正常黏附，可以使用細(xì)胞貼壁黏附劑，促進(jìn)其貼壁能力。

激光共聚焦培養(yǎng)皿：是一種中間有凹槽的小皿，用它的好處在于可以省去爬片制作的流程，但也要注意的是，有的普通熒光顯微鏡是無(wú)法檢測(cè)激光共聚焦培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，所以大家也要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇適宜的載體。

選擇好載體后，接下來(lái)要做的就是細(xì)胞接種。細(xì)胞接種的密度在1*105-1*106之間，因?yàn)椴煌?xì)胞生長(zhǎng)速度不一樣，可以大致摸一下最適細(xì)胞接種濃度。將細(xì)胞以最適濃度接種于含爬片的24孔板內(nèi)或者激光共聚焦培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱24小時(shí)（培養(yǎng)時(shí)間可以根據(jù)需要調(diào)整），使細(xì)胞貼壁。然后就是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，比如藥物啊，根據(jù)實(shí)際情況選擇。

處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定10-15min，用PBS進(jìn)行漂洗兩到三次。Triton X-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透，增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性，便于熒光染料進(jìn)入細(xì)胞。

熒光染色：按熒光試劑盒說(shuō)明書(shū)操作

復(fù)染：一般用DAPI染核（確定核的位置），DAPI染料染10min,PBS漂洗兩到三次。

封片：取出爬片。操作小技巧，最后漂洗的PBS留在孔內(nèi)，不要吸出來(lái)，一手持鑷子，一手持注射針，用針尖將爬片挑起（如果能將針尖彎成一個(gè)小鉤，就更方便了），鑷子取出，在載玻片上滴上約20ul封片劑（抗熒光猝滅劑），將帶細(xì)胞一面朝下，使封片劑均勻覆蓋爬片。激光共聚焦培養(yǎng)皿就無(wú)須取出爬片了。

采集圖像：普通熒光顯微鏡汞燈需要預(yù)熱，達(dá)到穩(wěn)定后使用，圖像采集過(guò)程中保證對(duì)焦清晰，背景盡量是黑色，最好不要過(guò)曝，熒光容易猝滅，宜盡快采集圖像。

圖像處理; 采集圖像后，我們會(huì)將DAPI和目的熒光的圖像Merge在一起。當(dāng)然，有的還會(huì)計(jì)數(shù)或者分析熒光強(qiáng)度，可以用ImageJ軟件進(jìn)行。

至于免疫熒光，其他操作基本相同，常用的也是4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定10-15min，用PBS進(jìn)行漂洗兩到三次。0.25%的Triton X-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透10min，但接下來(lái)用3%左右的BSA室溫半小時(shí)對(duì)多余位點(diǎn)進(jìn)行封閉是普通熒光染色沒(méi)有的。隨后就是孵育一抗，室溫1-2h或者4℃過(guò)夜，PBS洗滌，孵育帶熒光的二抗，PBS洗滌，封片（抗熒光猝滅劑）。