Western一抗二抗去除液

Western 一抗二抗去除液，用于 Western Blot 中轉(zhuǎn)移了蛋白的膜的重復(fù)利用。在 Western Blot 中完成了一抗二抗結(jié)合和后續(xù)的化學(xué)發(fā)光檢測后，有時還需要檢測 Actin、Tubulin 等內(nèi)參蛋白或檢測其它蛋白進(jìn)行比較。Western 一抗二抗去除液可變性已經(jīng)結(jié)合的抗體，使其失活，從而將同一張膜再用于其它抗體的雜交。與其它類型的一抗二抗去除液相比，該試劑不破壞抗原，處理過程中膜上抗原不丟失，因此可重復(fù)應(yīng)用的次數(shù)更多、靈敏度更高。
特征
操作簡單快速不會造成抗原蛋白的損失。
儲存：室溫可保存 2 年。
注意：該試劑為強(qiáng)烈的氧化劑，實(shí)驗(yàn)時務(wù)必做好防護(hù)工作。
如試劑接觸到皮膚，請用大量的水沖洗，并盡快就醫(yī)。
操作方法
(1) 將雜交完畢的膜置入蒸餾水中，室溫漂洗 5min。
(2) 漂洗結(jié)束后，棄去蒸餾水。
(3) 加入適量 Western 一抗二抗去除液（至少可覆蓋膜表面），室溫孵育 15min。
(4) 孵育結(jié)束后，棄去 Western 一抗二抗去除液。
(5) 加入適量蒸餾水，室溫漂洗 5min×4 次；漂洗結(jié)束后棄去蒸餾水。注意：每次漂洗務(wù)必將廢液倒干凈。
(6) 然后進(jìn)行封閉等后續(xù)操作，直至完成 Western Blot。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。