pCold-SUMO-10His原核蛋白表達(dá)試劑盒

描述：本試劑盒所包含的原核表達(dá)載體(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 載體基礎(chǔ)上改造而成，

該載體啟動(dòng)子(CS Promoter)來(lái)源于南極嗜冷細(xì)菌，在低溫下(15 度)才能啟動(dòng)蛋白的表達(dá)。低溫下細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性表達(dá)，增強(qiáng)了活性蛋白的表達(dá)比率。該表達(dá)系統(tǒng)所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達(dá)量，而且進(jìn)一步提高了蛋白的可溶表達(dá)幾率。同時(shí)，TEE 信號(hào)肽可增強(qiáng)冷啟動(dòng)子調(diào)控下目的蛋白的高表達(dá)。
改進(jìn)后的 pCold-SUMO-10His 載體，其 SUMO 蛋白標(biāo)簽含有 10 個(gè)組氨標(biāo)簽（10His tag），使其結(jié)合 Ni-NTA 的能力更強(qiáng)。與較早版本的 pCold-SUMO 表達(dá)系統(tǒng)相比，pCold-SUMO-10His 表達(dá)系統(tǒng)在保留了原有統(tǒng)的蛋白可溶性能生產(chǎn)能力、高特異性剪切能力的情況下，對(duì) Ni-NTA 結(jié)合能力的得到明顯提高。其對(duì) Ni-NTA 結(jié)合能力的提高，

在以下三個(gè)方面改善了生產(chǎn)重組蛋白的性能：

（1）提高了粗蛋白樣品中目標(biāo)蛋白的捕獲能力，從而提高純化產(chǎn)量；

（2）在蛋白純化過(guò)程中可以
使用更高濃度的咪唑進(jìn)行漂洗，去雜蛋白的能力明顯提升，從而獲得更高純度的重組蛋白；

（3）在重組蛋白酶切去除 SUMO標(biāo)簽后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標(biāo)簽更為，獲得純度更高的無(wú)標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白。
關(guān)于宿主菌的使用：本試劑盒配備了兩種宿主表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態(tài)，兩種感受態(tài)均為凍干品形式可長(zhǎng)期保存在-20℃，效價(jià)無(wú)明顯下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通常在質(zhì)粒載體的構(gòu)建完成，并測(cè)序驗(yàn)證后，可將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該感受態(tài)進(jìn)行蛋白表達(dá)。該宿主菌僅為蛋白表達(dá)生產(chǎn)用，不可以進(jìn)行載體構(gòu)建和質(zhì)粒的提取制備。由于 pCold-SUMO 系統(tǒng)的高可溶性表達(dá)特性，在大多數(shù)情況下重組蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)即可獲得理想的可溶表達(dá)，因此實(shí)驗(yàn)請(qǐng)選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)宿主菌可溶表達(dá)效果不理想的情況下，再選用操作相對(duì)復(fù)雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，該系統(tǒng)可獲得的可溶表達(dá)。除此外，pCold-SUMO 系統(tǒng)在常規(guī) BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內(nèi)均可獲得可觀的可溶性表達(dá)。
關(guān)于蛋白酶的使用：試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶（酵母來(lái)源，也稱(chēng)為 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在步載體構(gòu)建過(guò)程中需要評(píng)估、考慮兩個(gè)蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識(shí)別蛋白結(jié)構(gòu)，切割活性高、酶切，對(duì)于需要去除 Tag的重組蛋白其是。個(gè)別情況下 SUMO 標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)會(huì)受到 C 端重組目標(biāo)蛋白的影響，使得 SUMO 蛋白酶對(duì)重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無(wú)效，此時(shí)再選用 rTEV 蛋白酶進(jìn)行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識(shí)別氨基酸序列，個(gè)別重組融合蛋白會(huì)包埋識(shí)別序列，因此也會(huì)導(dǎo)致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結(jié)構(gòu)的無(wú)法預(yù)測(cè)性，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩種蛋白酶的酶切均需要測(cè)試。無(wú)論如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識(shí)別 SUMO標(biāo)簽結(jié)構(gòu)（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位點(diǎn)位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標(biāo)簽，保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結(jié)合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量約 26kD）。rTEV 蛋白酶可以識(shí)別 SUMO 標(biāo)簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在識(shí)別位點(diǎn) Gln-Gly(QG)之間進(jìn)行切割，從而去除 SUMO 標(biāo)簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標(biāo)簽（分子量約 30kD），可使用 Ni-NTA 純化介質(zhì)去除。
本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋白表達(dá)陽(yáng)性質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有 43kD 的目標(biāo)蛋白，其與SUMO 標(biāo)簽（19kD）融合后分子量約為 62kD。該表達(dá)質(zhì)粒在 Arctic (DE3)中即可獲得良好的表達(dá)。其可以?xún)H可做為表達(dá)、酶切實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照品。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。