rTEV蛋白酶

rTEV 蛋白酶（重組型）是經(jīng)過基因工程改造后的重組蛋白酶，該酶特異性識(shí)別 Glu-Asn- Leu-Tyr -Phe-Gln-Gly七氨基酸序列，并高特異性、高活性剪切(剪切位點(diǎn)在Gln-Gly之間)。該酶經(jīng) 6×His 標(biāo)簽純化而得(含組氨標(biāo)簽)，純度達(dá)99％，剪切反應(yīng)完畢后可通過 Ni-NTA Resin )去除。該酶在 4℃-30℃溫度、pH 范圍（6.0-8.5）反應(yīng)條件下均具有活性（見下表）。

活性定義：在 1×rTEV Buffer（50 mM，pH8.0, 0.5 mM EDTA,1mM DTT），30℃反應(yīng) 1h，剪切>85％的 3 μg 底物所需要的酶量定義為一個(gè)活性單位。
應(yīng)用：融合蛋白標(biāo)簽剪切去除。
儲(chǔ)存：長(zhǎng)期儲(chǔ)存-70℃，可儲(chǔ)存 2 年，-20℃可儲(chǔ)存 6 個(gè)月。
操作方法
1. 在 EP 管中配制如下反應(yīng)體系
融合蛋白 20 μg
20×rTEV Buffer 7.5 μl
0.1M DTT 1.5 μl
rTEV Protease 1-3 μl
ddH20 Up to 150 μl
2. 30℃孵育，在 1、2、4、6 小時(shí)分別吸出 30 μl 上述反應(yīng)液，置于單獨(dú)的 EP 管中。
3. 向上述 EP 管中加入 30 μl 2×SDS Loading Buffer，置于-20℃。
4. 樣品全部反應(yīng)完畢后，樣品煮沸 5 min，取 40 μl 進(jìn)行SDS-PAGE 分析。
5. 如融合蛋白要求低溫處理，可將反應(yīng)液置于 4℃，請(qǐng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，并增加 rTEV 酶用量。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。