Equi-phi29 DNA Polymerase

描述：Equi-phi29 DNA Polymerase 是 phi29 的改造體，并 經(jīng)多次純化分離而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的鏈置 換、連續(xù)合成特性（>70kb）的基礎(chǔ)上，提高了滾環(huán)擴增的 反應(yīng)溫度，該酶酶可以在 42 度條件下持續(xù)的進行 DNA 合成 （而 phi29 DNA 聚合酶在此溫度下反應(yīng)活性很低）。 這種高溫的反應(yīng)特性，在以下幾個方面對實驗有明顯的 提升：（1）在 NGS 測序中，其提升了高 GC 含量、回文結(jié) 構(gòu)等復(fù)雜模板的延伸能力，使得 NGS 的覆蓋度更均一，降 低測序所需深度；（2）高溫的反應(yīng)條件，提升了基因組 DNA 的 WGA 產(chǎn)物的合成量，并可以進行變溫擴增；（3）降低測 序中 Gap 區(qū)域，提升單細胞測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量和完整度；（4） 降低非特異性擴增產(chǎn)物；（5）提升 MDA/RCA 等實驗的擴增 性能和特異性。 除此外，該酶仍然具有很強的 3’→5’外切酶校讀功能， 合成的 DNA 片段保真性高。該酶的外切酶活性較強，因此 合成過程中引物需要 3’端硫代修飾，以降低外切活性對引物 的切割效應(yīng)。

儲存：-20℃可保存 3 年。
使用方法
1. 配制引物模板退火體系
10×phi29 Buffer 2 μl
dNTP Mixture (10 mM each) 1.2 μl
Template DNA 0.1-40 ng
硫代修飾的Oligo x μl
ddH2O Upto 19 μl
注意：在不同的實驗類型中，Oligo根據(jù)實驗需要自行選擇。
2. 引物和模板退火：體系配制完畢后，放置到 PCR 儀中，95℃ 3min，25℃ 3min。
3. 退火完畢后，向退火產(chǎn)物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase，混合均勻。
4. 擴增反應(yīng)
4.1 恒溫擴增
對于環(huán)狀DNA模板采用恒溫反應(yīng)作為推薦使用30℃恒溫擴增，30℃孵育 6~16h.該酶在 30-42℃條件下均可工作，必要時根據(jù)實驗類型進行調(diào)整。
4.2 變溫擴增
對于基因組 DNA 或 cDNA 模板，推薦使用變溫擴增反應(yīng)，以在短時間內(nèi)獲得更高產(chǎn)量，并提高了低濃度模板的擴增產(chǎn)量。在 PCR 儀上做如下設(shè)置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循環(huán) 72 次（約 6h）或 120次（約 10h）.必要時，反應(yīng)結(jié)束后，可于 65°C 10min 進行失活反應(yīng)。
使用注意事項
（1）必要時可單獨額外添加終濃度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA，可提高反應(yīng)效率。
（2）該酶的反應(yīng)溫度為 42 ℃ （在 30~42℃之間均有活性）。
（3）65℃ 10min 即可使該酶失活。
（4）根據(jù)實驗類型需要，調(diào)整dNTP的濃度100~500 μM。
（5）添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 產(chǎn)量。
（6）反應(yīng)引物 3’端的硫代修飾可避免引物降解。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。