Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒是百螢生物生產(chǎn)的一種基于 SST-8 的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。其主要成分為水溶性四唑鹽 SST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)。WST-8在電子耦合載體1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物（formazan），顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

1.CCK-8試劑盒和MTT試劑盒有什么區(qū)別？

答：CCK-8試劑盒和MTT試劑盒都是用于測(cè)量細(xì)胞活力的方法，但CCK-8試劑盒有以下優(yōu)勢(shì)：

（1）CCK-8試劑盒使用的WST-8比MTT更易被細(xì)胞還原，因此靈敏度更高，檢測(cè)時(shí)間更短；

（2）CCK-8試劑盒生成的甲臜產(chǎn)物是水溶性的，不需要添加有機(jī)溶劑或者洗滌細(xì)胞，操作更簡(jiǎn)單方便；

（3）CCK-8試劑盒對(duì)細(xì)胞毒性更小，不會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能。

2.CCK-8的工作原理是什么？

答：CCK-8試劑盒中的WST-8可以被活細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物還原為可溶性的形式。還原后的WST-8在存在電子耦合劑的條件下形成一種有色產(chǎn)物，其吸光度與細(xì)胞數(shù)量和代謝活性相關(guān)。通過(guò)測(cè)量吸光度的變化，可以間接評(píng)估細(xì)胞的增殖能力或毒性。

3. CCK的保存和穩(wěn)定性如何？

答：CCK穩(wěn)定性高，避光條件-20℃有效期2年，4℃有效期1年。經(jīng)常使用建議4℃保存，避免反復(fù)凍融。CCK正常顏色為粉紅色，若顏色發(fā)生明顯偏差，質(zhì)量可能有發(fā)生變化。

4.CCK的細(xì)胞毒性如何？

答：CCK毒性非常低，因此CCK檢測(cè)完后相同的細(xì)胞還能用于其它細(xì)胞增殖檢測(cè)如結(jié)晶紫染色法，中性紅染色法或DNA熒光染色法。

5.CCK會(huì)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色嗎？

答：不會(huì)，首先WST-8不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞染色，整個(gè)顯色反應(yīng)都是在培養(yǎng)體系中進(jìn)行的。另外WST和WST-8甲臜都屬于高度水溶性組分，反應(yīng)結(jié)束更換新的培養(yǎng)液，即可外源組分。

6.做細(xì)胞活性檢測(cè)時(shí)，每孔應(yīng)該接種多少個(gè)細(xì)胞？

答：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的小接種量至少為1,000個(gè)/孔(100 μL培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500個(gè)/孔(100 μL培養(yǎng)基)。

7.若是使用6孔或者24孔板進(jìn)行試驗(yàn)，CCK試劑使用量怎么樣呢？

答：如果要使用6孔板或24孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK溶液。

8.能否用384孔板進(jìn)行細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/span>

答：可以，CCK-8產(chǎn)品的使用量為每孔培養(yǎng)基總體積的10%。建議先將CCK-8產(chǎn)品稀釋一倍，然后加入培養(yǎng)基總體積的20%即可，這樣可減少誤差。

9.培養(yǎng)基的本底顏色如酚紅會(huì)不會(huì)影響細(xì)胞活性的檢測(cè)呢？

答：不會(huì)的，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

10.在加入CCK-8時(shí)可否不更換培養(yǎng)基？

答：一般情況下可以不更換培養(yǎng)基。但是如果培養(yǎng)基里有氧化還原性物質(zhì)的話，有可能會(huì)產(chǎn)生誤差，必須更換其它培養(yǎng)基。

11.只可以在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值嗎？

答：可以在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，但是若無(wú)此波長(zhǎng)的濾光片，可選擇吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測(cè)靈敏度高。

12.若是暫不檢測(cè)OD值，該如何處理？

答：若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化