Cy(Cyanine),也叫花青染料，是一系列在實(shí)驗(yàn)中很常見的熒光化合物。跟著百螢一起看看它們是怎么工作的吧！
1.問：Cy3、Cy5、Cy7是什么？光譜特性如何？適用于哪些應(yīng)用？
答：Cy3、Cy5和Cy7是一類熒光染料，常用于生物科學(xué)研究中的熒光標(biāo)記和成像。它們屬于氰化染料家族，可以在特定波長(zhǎng)下吸收光能，并在不同波長(zhǎng)下發(fā)射特定顏色的熒光信號(hào)。
Cy3的最大吸收波長(zhǎng)約為550納米，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為570納米；Cy5的最大吸收波長(zhǎng)約為650納米，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為670納米；Cy7的最大吸收波長(zhǎng)約為750納米，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為770納米。
Cy3、Cy5和Cy7廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中的熒光標(biāo)記。它們常用于熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色、蛋白質(zhì)和核酸定量等實(shí)驗(yàn)中。
2.問：Cy3NHS酯在動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)有哪些？
答：(1)Cy3標(biāo)記物在使用前需要稀釋到合適的濃度和pH值。一般推薦使用PBS或TBS緩沖液稀釋，避免使用含有氨基或巰基的緩沖液或添加劑，以防止與Cy3發(fā)生反應(yīng)或還原。Cy3標(biāo)記物的稀釋比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件而定，一般在1:200-1:1000之間。
(2)Cy3標(biāo)記物在使用過程中需要避免光照和高溫，以防止熒光淬滅或降解。Cy3標(biāo)記物可以在4°C避光保存數(shù)月，或者在-20°C避光保存數(shù)年。如果需要凍存，可以加入適量的甘油或DMSO作為凍存保護(hù)劑。
(3)Cy3標(biāo)記物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以用于尾靜脈注射，進(jìn)行活體成像。每次注射200μL(濃度0.5 mg/mL)，每5分鐘記錄一張動(dòng)物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光藥物的分布情況。對(duì)照鼠不注射藥物，進(jìn)行同時(shí)記錄。
3.問：磺化和非磺化的Cy3有什么區(qū)別？哪個(gè)更適合蛋白染色？
答：磺化的Cy3和非磺化的Cy3的主要區(qū)別是水溶性和標(biāo)記方法?；腔腃y3在發(fā)色團(tuán)上有兩個(gè)硫酸離子官能團(tuán)，所以它的水溶性很高，可以直接在水溶液中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，不需要有機(jī)溶劑助溶1。非磺化的Cy3的水溶性較低，需要預(yù)先溶解在有機(jī)溶劑(如DMF或DMSO)中，然后加入到生物分子的水溶液中反應(yīng)。如果被標(biāo)記的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑敏感，或者需要通過透析純化，那么磺化的Cy3是更好的選擇。另外，磺化的Cy3也有更好的光學(xué)穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率，發(fā)出的熒光更強(qiáng)更耐光照。兩種Cy3的熒光譜圖幾乎一樣，只是磺化的Cy3有微小的藍(lán)移。因此，在大多數(shù)情況下，兩種Cy3可以相互替換使用。百螢生物提供多種基團(tuán)的Cy染料，歡迎選購(gòu)
4.問：Cy3標(biāo)記植物組織和動(dòng)物組織，在實(shí)驗(yàn)操作上有什么區(qū)別？
答：Cy3標(biāo)記植物組織和動(dòng)物組織在操作上的區(qū)別可能取決于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头椒?，但是一般來說，有以下幾點(diǎn)需要注意：
(1)植物組織通常有較厚的細(xì)胞壁，可能影響染料的滲透和結(jié)合。因此，在標(biāo)記前可能需要用酶或機(jī)械方法處理植物組織，增加其滲透性；
(2)植物組織和動(dòng)物組織的pH值可能不同，這可能影響染料的穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度。因此，在選擇緩沖液時(shí)，需要考慮目標(biāo)組織的pH值，并且避免使用含有氨基的緩沖液，如Tris或甘an酸，以免與染料競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)；
(3)Cy3染料有脂溶性和水溶性兩種類型，脂溶性染料需要加入有機(jī)溶劑助溶，而水溶性染料不需要，水溶性染料通常更穩(wěn)定，更適合標(biāo)記對(duì)有機(jī)溶劑敏感的生物分子；
(4)Cy3染料可以與生物分子上的氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，因此在標(biāo)記時(shí)需要控制反應(yīng)條件和比例，以達(dá)到理想的標(biāo)記效率和熒光信號(hào)。一般來說，Cy3染料與目標(biāo)分子的摩爾比在4-12之間為宜。
5.問：Cy5 馬來酰亞胺能否標(biāo)記外泌體？如何操作？
答：Cyanine 5 maleimide是一種熒光染料，常用于對(duì)含有巰基的蛋白質(zhì)或肽鏈進(jìn)行標(biāo)記。該產(chǎn)品可以標(biāo)記外泌體，以下是一般的標(biāo)記步驟：
(1)準(zhǔn)備外泌體樣品：收集并純化外泌體樣品，確保樣品的純度和完整性。
(2)選擇適當(dāng)?shù)木彌_液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)。
(3)制備Cyanine 5 maleimide工作溶液：根據(jù)說明書，將Cyanine 5 maleimide溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，制備成工作濃度的溶液?br />
(4)反應(yīng)標(biāo)記：將外泌體樣品與Cyanine 5 馬來酰亞胺工作溶液混合，使其反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間和溫度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化，一般在室溫或較低溫下進(jìn)行。
(5)反應(yīng)停止：添加還原劑(如二巰基乙醇)以停止反應(yīng)，并消除未反應(yīng)的Cyanine 5 馬來酰亞胺。
(6)清洗和去除未結(jié)合的染料：使用適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液，如PBS，對(duì)標(biāo)記后的外泌體樣品進(jìn)行洗滌，以去除未結(jié)合的染料。
(7)分析和評(píng)估：使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)或其他適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，對(duì)標(biāo)記后的外泌體樣品進(jìn)行熒光檢測(cè)和分析。
參考文獻(xiàn)：Pishesha, N.; Harmand, T.; Smeding, L.; Ma, W.; Ludwig, L.; Janssen, R.; Islam, A.; Xie, Y.; Fang, T.; McCaul, N.; Pinney, W.; Sugito, H.; Ploegh, H. Single domain antibody-antigen adducts that target Class II MHC induce antigen-specific tolerance. Research Square, preprint. doi: 10.21203/rs.3.rs-192181/v1
6.問：Cy3酸和NHS酯有什么區(qū)別？適用性有什么不同？
答：Cy3 acid(貨號(hào)140)和NHS酯(貨號(hào)141)都是一種黃色熒光染料，用于標(biāo)記生物分子中的氨基。它們的區(qū)別在于反應(yīng)基團(tuán)的不同。Cy3 acid是一種羧酸，可以與活化劑(如EDC)反應(yīng)，形成活化羧酸，再與氨基反應(yīng)。Cy3 NHS酯是一種N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)，可以直接與氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。
Cy3 acid和NHS酯的適用性也有不同。Cy3 acid可以用于標(biāo)記含有羧基的分子，如核酸，通過轉(zhuǎn)化為NHS酯或其他活化形式。Cy3 NHS酯可以用于標(biāo)記含有氨基的分子，如蛋白質(zhì)，多
肽，或氨基修飾的核苷酸。Cy3 NHS酯比Cy3 acid更方便使用，因?yàn)椴恍枰~外的活化步驟。
7.問：Cy3馬來酰亞胺常用于什么染色？它和Cy3NHS酯的區(qū)別是什么？
答：Cy3馬來酰亞胺(貨號(hào)142)常用于標(biāo)記含有巰基的生物分子，比如半胱an酸和雙硫鍵等，然后用熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀觀察或檢測(cè)它們的熒光信號(hào)。它和Cy3NHS酯(貨號(hào)141)的區(qū)別主要在于：
(1)Cy3馬來酰亞胺可以和巰基反應(yīng)，而Cy3NHS酯可以和胺基反應(yīng)。
(2)Cy3馬來酰亞胺的標(biāo)記反應(yīng)比Cy3NHS酯的標(biāo)記反應(yīng)更快、更高效、更特異。
(3) Cy3馬來酰亞胺的水溶性較低，需要使用有機(jī)共溶劑，而Cy3NHS酯的水溶性較高，不需要使用有機(jī)共溶劑。
8.問：Cy3NHS酯和Cy3雙NHS酯在蛋白染色方面有什么區(qū)別？
答：在染色方面的區(qū)別主要是：
Cyanine 3 雙NHS酯(貨號(hào)138)含有兩個(gè)NHS基團(tuán)，可以與兩個(gè)氨基反應(yīng)，形成雙綴合物。這種染料可能會(huì)在一些蛋白質(zhì)上產(chǎn)生更高的熒光信號(hào)，但也可能會(huì)增加非特異性結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。
Cyanine 3 NHS酯(貨號(hào)141)含有一個(gè)NHS基團(tuán)，只能與一個(gè)氨基反應(yīng)，形成單綴合物 。這種染料是一種常用的染料，可以與多種生物分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，但也可能會(huì)降低熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
對(duì)于Cyanine 3 雙NHS酯，常用于標(biāo)記含有多個(gè)氨基的生物分子，如多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸等，也可以用于高靈敏度的熒光檢測(cè)，因?yàn)镃yanine 3 雙NHS酯在與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光大幅度增強(qiáng)。
Cy3 雙NHS酯注意事項(xiàng)：
(1)避免與含有羧基或硫醇基的生物分子反應(yīng)，因?yàn)檫@些基團(tuán)可能會(huì)與NHS基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致非特異性結(jié)合或副反應(yīng)。
(2)避免在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的條件下使用，因?yàn)檫@些條件可能會(huì)破壞染料的結(jié)構(gòu)或熒光性能。
9.問：Cy3酰肼可以用于哪些應(yīng)用領(lǐng)域？
答：Cyanine 3 酰肼(貨號(hào)146) 可以與含有醛基或酮基的分子反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰肼鍵。這種染料可以用于標(biāo)記經(jīng)過過氧化物酶氧化后的抗體和其他糖蛋白，或者標(biāo)記受到氧化應(yīng)激或脫氨作用的蛋白質(zhì)，或者標(biāo)記還原性的糖類。Cy3 NHS酯(貨號(hào)141)可以與含有氨基的分子反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。這種染料可以用于標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸中的氨基末端或伯胺。如果需要該類產(chǎn)品進(jìn)行蛋白/抗體染色，請(qǐng)根據(jù)目標(biāo)的反應(yīng)基團(tuán)和功能基團(tuán)，按
需選擇。
10.問：Cy3NHS酯標(biāo)記蛋白或抗體后，如何高效純化？
答：(1)(實(shí)驗(yàn)常用)用凝膠過濾層析法：將標(biāo)記反應(yīng)液通過大小孔徑合適的凝膠過濾柱，用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，收集流出液中的Cy3-蛋白標(biāo)記物，并測(cè)定蛋白濃度和熒光強(qiáng)度。這種方法簡(jiǎn)單快速，但可能會(huì)造成一些蛋白損失或稀釋。
(2)用逆相高效液相色譜法(RP-HPLC)：將標(biāo)記反應(yīng)液通過逆相C18柱，用不同比例的水和有機(jī)溶劑(如乙腈或甲醇)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集適當(dāng)?shù)纳珟Х澹鋬龈稍锖蟮玫紺y3-蛋白標(biāo)記物。這種方法可以有效地分離和純化Cy3-蛋白標(biāo)記物，但需要專業(yè)的儀器和操作技術(shù)。
(3)用親和層析法：如果待標(biāo)記的蛋白具有特定的親和性，可以利用親和層析法進(jìn)行純化。例如，如果待標(biāo)記的蛋白是抗體，可以用蛋白A或蛋白G柱進(jìn)行純化；如果待標(biāo)記的蛋白是GST融合蛋白，可以用gu胱甘肽柱進(jìn)行純化。這種方法可以保留蛋白的活性和穩(wěn)定性，但需要特定的親和配體和緩沖液。
11.問：Cy3鏈霉親和素和Cy3NHS酯在蛋白的標(biāo)記方面有何區(qū)別？
答：Cy3鏈霉親和素(貨號(hào)16912)是一種將Cy3熒光染料與鏈霉親和素(streptavidin)結(jié)合的偶聯(lián)物，可以用于檢測(cè)生物su化的生物分子，例如抗體、配體或DNA探針。
它可以用于間接標(biāo)記法，即先用生物su化的一級(jí)抗體或其他生物su化的探針與目標(biāo)蛋白結(jié)合，然后用Cy3鏈霉親和素與生物su結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)。
Cy3鏈霉親和素的操作方法取決于所使用的生物su化探針的類型和濃度，一般來說，需要先將樣品與生物su化探針孵育，然后用PBS或其他適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌去除多余的探針，再加入適量的Cy3鏈霉親和素孵育，最后再次洗滌去除多余的偶聯(lián)物，就可以進(jìn)行熒光檢測(cè)了。
12.問：Cy3疊氮化物和炔烴有什么關(guān)系？這兩個(gè)產(chǎn)品如何標(biāo)記蛋白？
答：Cy3炔烴(貨號(hào)144)和疊氮化物(貨號(hào)143)可以在銅催化下發(fā)生[3+2]環(huán)加成反應(yīng)，生成1,4-二取代的1,2,3-三唑衍生物，這種衍生物是Cy3染料的一種形式。
這種反應(yīng)屬于點(diǎn)擊化學(xué)的范疇，因?yàn)樗歉咝?、選擇性和正交的，即它不會(huì)受到其他官能團(tuán)的干擾，也不會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物。
Cy3炔烴和疊氮化物可以用來標(biāo)記蛋白的方法是，將含有Cy3炔烴的蛋白和含有疊氮化物的標(biāo)記分子(如抗體或其他配體)在銅催化下發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑連接，從而實(shí)現(xiàn)蛋白的熒光標(biāo)記。
這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，它可以在溫和的條件下進(jìn)行，不會(huì)破壞蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，而且反應(yīng)選擇性高，不會(huì)受到其他官能團(tuán)的干擾。 另外，Cy3染料是一種亮度高，熒光穩(wěn)定，對(duì)pH不敏感的橘黃色熒光染料，它可以用532 nm激光線激發(fā)，并用TRITC濾光片組觀察。
13.問：Cy3 TCO是什么？它與Cy3 NHS相比有什么區(qū)別？
答：Cy3反式環(huán)辛烯 [Cy3 TCO](貨號(hào)900)是一種熒光染料，可以與四唑類化合物發(fā)生快速的點(diǎn)擊反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共軛物。Cy3 TCO的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)速度快，無毒，適用于多種生物體系。缺點(diǎn)是染料分子較大，可能影響標(biāo)記分子的活性或穩(wěn)定性。
Cy3反式環(huán)辛烯 [Cy3 TCO]和Cy3 NHS酯 [Cy3 NHS]是兩種不同的熒光染料，它們都可以用于標(biāo)記含有氨基的生物分子，但是它們的反應(yīng)機(jī)制和條件有所不同。Cy3 TCO是一種點(diǎn)擊化學(xué)試劑，它可以與四唑類化合物發(fā)生快速的無副產(chǎn)物的環(huán)加成反應(yīng)。這種反應(yīng)可以在水相或有機(jī)相中進(jìn)行，不受pH、溫度、緩沖液等因素的影響。Cy3 NHS酯是一種活化酯試劑，它可以與氨基形成酰胺鍵3。這種反應(yīng)需要在pH 7-9的緩沖液中進(jìn)行，且受到水解、氨基競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響。因此，Cy3 TCO比Cy3 NHS酯具有更高的反應(yīng)效率和選擇性，更適合標(biāo)記活性或穩(wěn)定性較低的生物分子。所以如果需要標(biāo)記含氨基的生物分子，選擇不止Cy3NHS酯，Cy3 TCO也許是您實(shí)驗(yàn)的更優(yōu)良選擇，考慮自己的實(shí)驗(yàn)條件，選擇最佳產(chǎn)品，可以事半功倍。
14問：Cy3四嗪是什么？它與其他常見的Cy3染料有何不同？
答：Cy3 tetrazine(貨號(hào)910)和其他Cy3染料的主要區(qū)別在于它們的反應(yīng)基團(tuán)和反應(yīng)方式。Cy3 tetrazine是一種帶有四唑基團(tuán)的熒光探針，它可以與TCO(反式-環(huán)辛烯)或其他應(yīng)力烯烴發(fā)生特異性的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的生物結(jié)合物。這種反應(yīng)具有快速、高效、無毒和無銅的優(yōu)點(diǎn)。
15.問：PE-Cy5 Tandem和普通的Cy5染料相比，有什么優(yōu)勢(shì)？
答：(1)PE-Cy5 Tandem(貨號(hào)2610)與FITC、PE在光譜上重疊范圍小，熒光干擾少，因此實(shí)驗(yàn)中常將PE-Cy5 Tandem與FITC、PE搭配使用。普通的Cy5染料與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的非特異性結(jié)合多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
(2)PE-Cy5 Tandem具有較高的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性，可用于標(biāo)記表達(dá)水平較低的蛋白。普通的Cy5染料的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性較低，適用于標(biāo)記表達(dá)水平較高的蛋白。
(3)二者的染色步驟類似，主要根據(jù)蛋白的表達(dá)水平選擇適合自己實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)品。
16問：Cy5DIGE NHS酯是什么？它和Cy5NHS酯有什么區(qū)別？
答：Cy5DIGE NHS ester(貨號(hào)25306)是一種專門用于差異凝膠電泳(DIGE)分析的染料，它可以與C2DIGE和/或C3DIGE一起使用，來比較兩個(gè)或三個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)。Cy5DIGE NHS ester具有遷移匹配和高分辨率的蛋白質(zhì)檢測(cè)能力。Cy5NHS則是一種更通用的染料，它可以用于標(biāo)記核酸分子(DNA和RNA)以及其他生物分子。
