百螢問號(hào)：熒光素酶到底該如何檢測(cè)？

時(shí)間：2023/8/1閱讀：64

如果您正在做一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，它需要檢測(cè)熒光素酶，而這是您的第一次熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，您可能會(huì)有很多問題和假設(shè)。那么，究竟如何入門該實(shí)驗(yàn)，您又該注意哪些方面的問題？別著急，百螢為您一一解答。

1.什么是螢光素/螢光素酶反應(yīng)?它如何起作用？

在自然界中，當(dāng)化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能時(shí)，就會(huì)發(fā)生生物發(fā)光。螢火蟲，真菌和海洋生物等許多生物都出于多種原因出現(xiàn)生物發(fā)光。當(dāng)螢光素酶催化螢光素的氧化導(dǎo)致發(fā)光時(shí)，就會(huì)發(fā)生該過程。反應(yīng)機(jī)理如下圖所示：

2.螢光素酶檢測(cè)的主要目的是什么？

螢光素酶是檢測(cè)啟動(dòng)子強(qiáng)度和活性的好方法。例如，如果您想研究啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，可以將熒光素酶基因置于啟動(dòng)子后面。轉(zhuǎn)錄該基因后，您將根據(jù)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度知道自己是否具有強(qiáng)大的啟動(dòng)子。檢測(cè)中產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光意味著更多的熒光素酶被轉(zhuǎn)錄，這意味著您具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子。您也可能會(huì)遇到的另一個(gè)問題是，如果要檢測(cè)基因表達(dá)，何時(shí)選擇熒光素酶測(cè)定法，何時(shí)選擇qPCR。要記住的是：qPCR方法將測(cè)量基因的轉(zhuǎn)錄本。它不會(huì)告訴您轉(zhuǎn)錄的控制。但是，使用螢光素酶可以測(cè)量啟動(dòng)子的和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。還要考慮的另一件事是，您想要研究基因調(diào)控的深度。您可能會(huì)發(fā)現(xiàn)，必須同時(shí)執(zhí)行這兩種技術(shù)才能了解項(xiàng)目的主要方面。

3.我需要什么進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)？

領(lǐng)域	研究類型	試劑	儀器	孔板/管
生物光學(xué)成像	細(xì)胞、活體動(dòng)物（如：小鼠）	熒光素酶檢測(cè)試劑/熒光素酶檢測(cè)試劑盒	酶標(biāo)儀/單管發(fā)光儀	微孔板/微量離心管

注：

1.試劑：您可以選擇一個(gè)試劑盒來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，它會(huì)包含您需要的所有必要成分；您也可以選擇試劑，再配制或購(gòu)買其他實(shí)驗(yàn)中的必要成分。如果您購(gòu)買的是單獨(dú)的產(chǎn)品，那么我們建議您考慮質(zhì)量，尤其是在熒光素方面。純度的差異會(huì)產(chǎn)生影響。而試劑盒具有相當(dāng)大的便利性，例如，您不必制作緩沖液，因?yàn)樵噭┖兄幸呀?jīng)提供了它。制備螢光素儲(chǔ)液時(shí)，無需稱量，因?yàn)槟奈灩馑匾呀?jīng)過測(cè)量。它還在您的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中提供了統(tǒng)一性。

2.儀器：首先檢查您的儀器是酶標(biāo)儀還是單管發(fā)光儀，找出您的儀器是否帶有進(jìn)樣器。并找出您的儀器在什么波長(zhǎng)下工作以及在什么溫度下工作。所有這些都將幫助您進(jìn)一步規(guī)劃實(shí)驗(yàn)。（酶標(biāo)儀允許您讀取孔板中的樣品。通常范圍在96到384之間；單管發(fā)光儀，將讀取單個(gè)微量離心管。）

3.孔板/管：對(duì)于這種測(cè)定類型，必須使用平坦的底板（不要使用圓底的孔板）。它們是專門為光學(xué)檢查和細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用而設(shè)計(jì)的。透明的孔板使您可以看到裂解物，但缺點(diǎn)是相鄰的孔中的背景可能會(huì)影響您的觀察。白色的孔板可以防止出現(xiàn)這種背景。但是，您看不到自己的裂解物。底部透明的白板可以解決可見性和背景問題，但價(jià)格昂貴。如何選擇，取決于您的實(shí)驗(yàn)需求及資金。

4.螢光素酶檢查的基本步驟是什么？

熒光素酶檢查的步驟非常相似，您是進(jìn)行雙重報(bào)告基因分析還是單個(gè)報(bào)告基因。基本步驟如下：

a. 選擇熒光素酶報(bào)道基因（螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶等）。如果要進(jìn)行雙重報(bào)告基因檢測(cè)，則螢光素酶需要進(jìn)行不同的光譜檢查。

b. 將報(bào)告基因克隆到質(zhì)粒中。如果您要進(jìn)行雙重報(bào)告基因檢測(cè)，則將其他報(bào)告基因克隆到單獨(dú)的質(zhì)粒中。

c. 將質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。

d. 經(jīng)過24至48小時(shí)培養(yǎng)后，取出培養(yǎng)基并裂解細(xì)胞。

e. 將包含螢光素的緩沖液添加到裂解物中，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

這些是您可以遵循的一般步驟。實(shí)際情況應(yīng)根據(jù)您要執(zhí)行的分析類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，調(diào)整實(shí)驗(yàn)方法。

相關(guān)試劑

分類	品名	貨號(hào)	Ex/Em（nm）
試劑	熒光素酶重組熒光素	#12500	/
	D-熒光素游離酸	#12501/#12502/#12503	328/533
	D-熒光素鉀鹽	#12505/#12506/#12507	328/533
	D-熒光素na鹽	#12509/#12510/#12511	328/533
	D-熒光素磷酸鹽	#12512	328/533
	D-熒光素半乳糖苷	#12513	328/533
	D-熒光素甲酯	#12514	328/533
	D-熒光素乙酯	#12515	328/533
	D-熒光素醋酸	#12516	328/533
試劑盒	Amplite 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒	#12518/#12519/#12520	/
	Amplite 高斯熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒	#12530/#12531/#12532	429/466
	Amplite 海腎熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒	#12535/#12536/#12537	429/466

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