我們的Amplite™熒光Caspase 3/7檢測試劑盒使用Ac-DEVD-AMC作為Caspase 3/7活性的熒光指示劑。AMC肽幾乎不發(fā)熒光。 Caspase 3/7對AMC肽的切割產(chǎn)生強(qiáng)熒光AMC，其在440-460nm下熒光監(jiān)測，激發(fā)340-350nm。 它可用于使用熒光酶標(biāo)儀或熒光計(jì)連續(xù)測量細(xì)胞提取物和純化酶制劑中Caspase 3/7的活性。百螢生物是AAT Bioquest 的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Caspase 檢測試劑/試劑盒。

產(chǎn)品適用儀器

熒光酶標(biāo)儀

Ex：350nm    Em:450nm   Cutoff:420nm

推薦孔板：純黑色孔板

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測定示例

概述

用測試化合物制備細(xì)胞（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）

加入等體積的Caspase 3/7測定溶液

在室溫下孵育1小時(shí)

監(jiān)測Ex的熒光強(qiáng)度 / Em = 350 / 450nm

操作方法

1.準(zhǔn)備細(xì)胞：

1.1對于貼壁細(xì)胞：在生長培養(yǎng)基中將細(xì)胞在20,000至80,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 90L過夜，96孔板或5,000至20,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2對于非粘附細(xì)胞：從培養(yǎng)基中離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基濃度為80,000至200,000細(xì)胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D賴氨酸平板或20,000至50,000細(xì)胞/孔/ 20L用于384孔聚-D賴氨酸板。在實(shí)驗(yàn)之前，在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下以800rpm離心板2分鐘。

注意：應(yīng)對每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的佳細(xì)胞密度。

2.準(zhǔn)備庫存解決方案：

2.1在使用前，在室溫下使用組分A，B，C（如果需要，組分D）。

2.2如果需要，制備1mM Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲備液：將100μLDMSO（未提供）直接加入到Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO小瓶中（組分D） ）。該抑制劑可用于確認(rèn)熒光信號強(qiáng)度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。

注意：應(yīng)將未使用的抑制劑儲備液等分并在-20°C下干燥儲存。

3.準(zhǔn)備Caspase 3/7檢測溶液：

將50μL200XCaspase 3/7底物儲備溶液（組分A）和100μL1MDTT溶液（組分C）加入10mL測定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X Caspase 3/7底物儲備液足以進(jìn)行100次分析，每次分析的反應(yīng)體積為100μL。未使用的200X Caspase 3/7底物儲備溶液應(yīng)等分并在-20°C下干燥儲存。遠(yuǎn)離光明。

4.運(yùn)行Caspase 3/7測定：

4.1通過在PBS或所需緩沖液中加入10μL10X測試化合物（96孔板）或5μL5X測試化合物（384-板）來處理細(xì)胞。對于空白孔（沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相應(yīng)量的化合物緩沖液。

4.2將細(xì)胞板在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需的一段時(shí)間（用喜shu堿處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Caspase 3/7測定溶液（來自步驟3）。

4.4在室溫下孵育板至少1小時(shí)，避光。

注1：如果需要，在室溫下加入測定溶液10分鐘前，將1L Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1mM儲備液（來自步驟2.2）加入所選樣品，以確認(rèn)caspase 3 / 7個(gè)類似的活動(dòng)。

4.5在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下，以800rpm離心細(xì)胞板（特別是對于非貼壁細(xì)胞）2分鐘。

4.6在Ex / Em = 350 / 450nm處觀察熒光增加。

圖1。TA 嵌合體對脂質(zhì)體 Dox 介導(dǎo)的半胱天冬酶3/7活化的影響。將 HeLa M (A)和 BeWo (B)細(xì)胞與含有或不含摻入 TA 蛋白的 Dox 載脂質(zhì)體一起溫育。培養(yǎng)48小時(shí)后測定半胱天冬酶3和7的活性。顯示的值表示為使用未處理的單元格獲得的值的百分比。誤差棒對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3) ，獲得的值相對于無蛋白質(zhì) Dox 負(fù)載的脂質(zhì)體的顯著性是通過單因素方差分析測試(* 表示 p < 0.05)確定的。來源: 牛蛙卵中的唾液酸結(jié)合凝集素在體外和體內(nèi)抑制人類間皮瘤細(xì)胞的生長，Takeo Tatsuta 等人，公共科學(xué)圖書館，2018年1月。

圖2。ONA 對小鼠腫瘤進(jìn)展的影響。作為小鼠卵巢癌模型，C57B6小鼠在右側(cè)卵巢中注射 iMOC 細(xì)胞并施用 ONA (20mg/kg) ，如示意圖(A)所示。大多數(shù)未經(jīng)處理的 C57B6小鼠在第40天死于癌癥轉(zhuǎn)移。評估存活時(shí)間(B)和腫瘤重量(C，比例尺: 1厘米)。使用免疫染色評估 STAT3活化(D，比例尺: 20μm) ，半胱天冬酶 -3活化(E，比例尺: 200μm)和巨噬細(xì)胞(F)在腫瘤組織中的浸潤。報(bào)道了 Iba-1陽性巨噬細(xì)胞中 F4/80陽性細(xì)胞和 CD163陽性細(xì)胞的百分比(F)。然后，將裸鼠在腹腔內(nèi)注射 ES2細(xì)胞并給予 ONA (20mg/kg) ，如示意圖(G)所示，然后測定存活率(G)。大多數(shù)未經(jīng)治療的裸鼠在第20天死于癌癥轉(zhuǎn)移。來源: 洋蔥素 A 通過抑制癌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞的腫瘤功能來抑制卵巢癌的進(jìn)展。

圖3。ONA 聯(lián)合抗癌藥物對 EOC 細(xì)胞的聯(lián)合作用。將 EOC 細(xì)胞(SKOV3，es2和 RMG1)與單個(gè)抗癌藥物(PTX，CBDCA 或 CDDP)和 ONA 的無效濃度的組合溫育24小時(shí)，然后使用 WST-8測定法(a)測定細(xì)胞增殖，并確定每種抗癌藥物對每個(gè)細(xì)胞系的無效濃度。此外，EOC 細(xì)胞與抗癌藥物和 ONA 一起溫育4小時(shí)，然后進(jìn)行半胱天冬酶 -3測定(B)。數(shù)據(jù)以平均值 ± SD 表示。* 與對照相比，p 值 < 0.05，* * p 值 < 0.01(不含抗癌藥物)。此外，將每種 EOC 細(xì)胞系(SKOV3: C，ES2: D 和 RMG1: E)與含有或不含 ONA 的每種抗癌藥物(PTX，CBDCA 和 CDDP)的無效濃度一起溫育3小時(shí)，然后通過 Western 印跡分析測量 pSTAT3，STAT3和 β-肌動(dòng)蛋白，如材料和方法中所述。來源: 洋蔥素 A 通過抑制癌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞的腫瘤功能來抑制卵巢癌的進(jìn)展。