百螢課堂之肌動蛋白的染色方案

時間：2023/11/22閱讀：56

肌動蛋白是形成微絲的高度保守的蛋白質(zhì)家族，由于其在真核細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)含量豐富，在微摩爾濃度范圍內(nèi)，肌動蛋白參與的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用比任何其他已知蛋白質(zhì)都要多。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已被證明在定位固定細(xì)胞和組織中的肌動蛋白絲以及在體外觀察單個肌動蛋白絲方面非常有用。

肌動蛋白具有從其單體狀態(tài)聚合成絲狀肌動蛋白（F-肌動蛋白）的特別能力。F-肌動蛋白和調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用迅速組裝和分解肌動蛋白絲，將其組織成肌動蛋白束和細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)。這些高階結(jié)構(gòu)為多種細(xì)胞過程提供必要的結(jié)構(gòu)支持，包括細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞運(yùn)動、極性和細(xì)胞形狀、基因調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因為肌動蛋白在許多生物過程中是不能缺少的，所以研究中必須使用工具（肌動蛋白特異性抗體和鬼筆環(huán)肽衍生染色劑）來觀察這些肌動蛋白結(jié)構(gòu)。

圖1.核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號17548）

圖2.MitoLite線粒體綠色熒光探針（貨號22675）

圖3.核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號23125）

圖4.復(fù)合圖片

熒光合成頭像。使用MitoLite線粒體綠色熒光探針（貨號22675）對活Hela細(xì)胞進(jìn)行染色并成像。在4%甲醛中固定后，用核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號23125）和核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料（貨號17548）對細(xì)胞進(jìn)行染色。

肌動蛋白染色方案

以下是鬼筆環(huán)肽-iFluor 488標(biāo)記（貨號23115）對培養(yǎng)細(xì)胞中的F-肌動蛋白進(jìn)行染色的示例方案。

注意：

1.鬼筆環(huán)肽是有毒的，應(yīng)小心處理；

2.在適當(dāng)條件下儲存時，鬼筆環(huán)肽-iFluor綴合物可穩(wěn)定至少6個月，如果不立即使用，請將它儲存在-20℃以下，避光并避免凍融循環(huán)。

材料：

1.鬼筆環(huán)肽-iFluor 488標(biāo)記（貨號23115）

2.PBS緩沖液

3.3.0-4.0%無甲醛甲醇

4.牛血清蛋白

5.細(xì)胞培養(yǎng)

方案如下：

1.將鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記小瓶加熱至室溫，并在打開前短暫離心。

2.將30uL 1000X 鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記DMSO溶液添加到1mL含1%牛血清蛋白中，制備1X 鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記工作溶液，并將溶液充分混合。這使得染色溶液足以用于10個孔，每孔100uL。將未使用的1000X鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記DMSO庫存溶液等分并在適當(dāng)?shù)臈l件下儲存。

注意：

1.不同細(xì)胞類型的染色可能有所不同。為了獲得好的性能，應(yīng)相應(yīng)地制備鬼筆環(huán)肽結(jié)合物工作溶液的濃度。

2.將細(xì)胞在含 3.0 - 4.0% 無甲醛甲醇的牛血清蛋白溶液中室溫固定 10 至 30 分鐘。避免使用任何含有甲醇的固定劑，因為甲醇會在固定過程中破壞肌動蛋白。

3.小心吸出固定液。

4.在牛血清蛋白中沖洗固定細(xì)胞2-3次。

5.用牛血清蛋白中的 10 mM 乙醇胺淬滅過量的甲醛 5 分鐘。

6.在 96 孔板中，向細(xì)胞中添加 100 μL/孔的鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記工作溶液。在室溫下將細(xì)胞染色 20 至 90 分鐘。

7.用牛血清蛋白輕輕沖洗細(xì)胞 2 至 3 次，以去除多余的鬼筆環(huán)肽結(jié)合物。

8.使用配備適當(dāng)濾光片組的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。鬼筆環(huán)肽-iFluor488標(biāo)記需要 FITC 濾光片組才能可視化。

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