ReadiLink 快速抗體標(biāo)記試劑盒提供了一種以微觀方式標(biāo)記抗體的便捷方法。 該試劑盒僅需要兩個(gè)簡單的混合步驟而無需純化步驟。試劑盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亞胺酯（SE）顯示出與蛋白質(zhì)的脂族胺的良好反應(yīng)性和選擇性，并形成羧酰胺鍵，其與天然肽鍵相同且穩(wěn)定。 iFluor 和mFluor-抗體綴合物可用于免疫熒光染色，熒光原位雜交，流式細(xì)胞術(shù)和其他生物學(xué)應(yīng)用。每個(gè)ReadiLink Rapid抗體標(biāo)記試劑盒都提供了進(jìn)行兩次偶聯(lián)反應(yīng)（2x50μg蛋白質(zhì)）的所有必需成分。每個(gè)試劑盒可用于標(biāo)記50-100μg單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質(zhì)（> 10 kDa），只需兩個(gè)簡單的混合步驟。

 Readilink 快速試劑盒標(biāo)記原理

1.通過在反應(yīng)緩沖液（pH 7.5-8.5）中將標(biāo)記染料與蛋白質(zhì)（待標(biāo)記的）混合，開始標(biāo)記反應(yīng)2.孵育得到所需蛋白質(zhì)綴合物和非反應(yīng)性游離染料的混合物。

3.通過將非熒光Tide Quencher （TQ）染料與反應(yīng)溶液混合來淬滅反應(yīng)。TQ染料阻止反應(yīng)并將非反應(yīng)性自由標(biāo)記染料轉(zhuǎn)化為非熒光TQ標(biāo)記染料復(fù)合物，這消除了游離標(biāo)記染料的背景熒光干擾。

 

試劑盒組成

 

標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（標(biāo)記50μg蛋白質(zhì)）

將所有組分加熱并在打開前將樣品瓶短暫離心，并在開始結(jié)合前立即準(zhǔn)備所需的溶液。 以下SOP是標(biāo)記抗HDAC IgG抗體的實(shí)例。

 

1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)溶液（溶液A）：

為了標(biāo)記50μg蛋白質(zhì)（假設(shè)目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為1 mg / mL），將5μL（總反應(yīng)體積的10％）反應(yīng)緩沖液（組分B）與50μL目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液混合。

注1：如果蛋白質(zhì)濃度不同，請相應(yīng)調(diào)整蛋白質(zhì)體積，使~50μg蛋白質(zhì)可用于標(biāo)記反應(yīng)。

注2：為了標(biāo)記100μg蛋白質(zhì)（假設(shè)目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為1 mg / mL），將10μL（總反應(yīng)體積的10％）反應(yīng)緩沖液（組分B）與100μL目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液混合。

注3：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中;如果蛋白質(zhì)溶解在甘氨酸緩沖液中，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（來自Millipore的cat＃UFC501008）去除游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）。

注4：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體。                                 

注5：如果蛋白質(zhì)濃度低于1 mg / mL，結(jié)合效率會(huì)顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為1-2 mg / mL。

 

2.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：

2.1將蛋白質(zhì)溶液（溶液A）加入一小瓶標(biāo)記染料（組分A）中，通過反復(fù)移液幾次將其充分混合，或?qū)⑿∑繙u旋幾秒鐘。

注意：使用標(biāo)記染料的兩個(gè)小瓶（組分A）通過將100μg蛋白質(zhì)分成2x50μg蛋白質(zhì)并使每個(gè)50μg蛋白質(zhì)與一小瓶標(biāo)記染料反應(yīng)來標(biāo)記100μg蛋白質(zhì)。 將兩個(gè)小瓶合并用于下一步。

2.2將綴合反應(yīng)混合物在室溫下保持30-60分鐘。

注意：如果需要，可以旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)綴合反應(yīng)混合物更長的時(shí)間。

 

3.停止共軛反應(yīng)：

3.1加入5uL（50μg蛋白質(zhì)）或10μL（100μg蛋白質(zhì)），這是TQ染色猝滅緩沖液（組分C）總反應(yīng)體積的10％到共軛反應(yīng)混合物中（來自步驟2.2），混合。

3.2在室溫下孵育10分鐘。

3.3使用標(biāo)記的蛋白質(zhì)（抗體）。

 

蛋白質(zhì)共軛物的儲(chǔ)存

蛋白質(zhì)綴合物應(yīng)在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲(chǔ)存。 為了更長時(shí)間的儲(chǔ)存，可以將蛋白質(zhì)綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-20℃下儲(chǔ)存。

 

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