方案一：一個(gè)96孔板的測(cè)定方案

以下說明書僅提供指南，實(shí)際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

概述

準(zhǔn)備蛋白酶底物溶液（50μL）

加入底物對(duì)照，陽性對(duì)照或測(cè)試樣品（50μL）

孵育0分鐘（用于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)）或30分鐘-1小時(shí)（用于終點(diǎn)讀數(shù)）

在Ex / Em = 490 / 525nm處監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。

操作方法

1.準(zhǔn)備工作解決方案：

1.1制備蛋白酶底物溶液：在2X測(cè)定緩沖液（組分C）中以1：100稀釋蛋白酶底物（組分A）。在96孔板中每次測(cè)定使用50μL蛋白酶底物溶液。

注意：2X分析緩沖液（組分C）設(shè)計(jì)用于檢測(cè)胰凝*蛋白酶，胰*白酶，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性。對(duì)于其他蛋白酶，請(qǐng)參閱附錄I了解適當(dāng)?shù)姆治鼍彌_液配方。

1.2胰*白酶稀釋：在去離子水中以1:50稀釋胰*白酶（5U /μL，組分B），得到濃度為0.1U /μL。

2.根據(jù)說明書中的表1和表2，將步驟1中制備的試劑加入96孔微量培養(yǎng)板中。

3.運(yùn)行酶促反應(yīng)：

3.1將50μL蛋白酶底物溶液（來自步驟1.1）加入到測(cè)定板中的所有孔中，充分混合試劑。

3.2用Ex / Em = 490 / 525nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加。

對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)：立即開始連續(xù)測(cè)量熒光強(qiáng)度，每5分鐘記錄數(shù)據(jù)30分鐘。

終點(diǎn)讀數(shù)：將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至60分鐘，避光，測(cè)量熒光強(qiáng)度。

方案二：使用純化酶篩選蛋白酶抑制劑

概述

準(zhǔn)備蛋白酶底物溶液（10μL）添加底物對(duì)照，陽性對(duì)照，載體對(duì)照或測(cè)試樣品（90μL）

孵育0分鐘（用于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)）或30分鐘-1小時(shí)（用于終點(diǎn)讀數(shù)）

監(jiān)測(cè)Ex的熒光強(qiáng)度 / Em = 490 / 525nm

操作方法

1.準(zhǔn)備工作解決方案：

1.1制備1X測(cè)定緩沖液：將5mL去離子水加入5mL 2X測(cè)定緩沖液（組分C）中。

1.2制備蛋白酶底物溶液：在1X測(cè)定緩沖液（來自步驟1.1）中以1:20稀釋蛋白酶底物（組分A）。使用10μL/孔的蛋白酶底物溶液用于96孔板。

注意：2X測(cè)定緩沖液（組分C）設(shè)計(jì)用于檢測(cè)胰凝*蛋白酶，胰*白酶，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性。 對(duì)于其他蛋白酶，請(qǐng)參閱附錄I了解適當(dāng)?shù)姆治鼍彌_液配方。

1.3蛋白酶稀釋：將蛋白酶在1X測(cè)定緩沖液中稀釋至濃度為500-1000nM。每個(gè)孔需要10μL蛋白酶稀釋液。為所有測(cè)試樣品準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)牧?，并為陽性?duì)照和載體對(duì)照孔準(zhǔn)備額外的量。

2.根據(jù)說明書中的表1和表2，將步驟1中制備的試劑加入96孔微量培養(yǎng)板中。

3.運(yùn)行酶促反應(yīng)：

3.1將10μL蛋白酶底物溶液（來自步驟1.2）加入陽性對(duì)照（PC），載體對(duì)照（VC）和測(cè)試樣品（TS）的孔中。 充分混合試劑。

3.2用Ex / Em = 490 / 525nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)：立即開始連續(xù)測(cè)量熒光強(qiáng)度，每5分鐘記錄數(shù)據(jù)30分鐘。

終點(diǎn)讀數(shù)：將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至60分鐘，避光。 然后測(cè)量熒光強(qiáng)度。