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生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

目的基因的PCR克隆

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5.1實(shí)驗(yàn)原理 
5.1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基本構(gòu)成 
PCR指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定模板(克隆或基因組DNA)的擴(kuò)增反應(yīng),是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程,在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的一種技術(shù),在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用,包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。 
PCR基本原理是以單鏈DNA為模板,4種dNTP為底物,在模板3’末端有引物存在的情況下,用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸,多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到程度的擴(kuò)增。在微量離心管中,加入與待擴(kuò)增的DNA片段兩端已知序列分別互補(bǔ)的兩個(gè)引物、適量的緩沖液、微量的DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq dna聚合酶、Mg2+等。反應(yīng)時(shí)先將上述溶液加熱,使模板DNA在高溫下變性,雙鏈解開為單鏈狀態(tài);然后降低溶液溫度,使合成引物在低溫下與其靶序列配對,形成部分雙鏈,稱為退火;再將溫度升至合適溫度,在Taq DNA聚合酶的催化下,以dNTP為原料,引物沿5’→3’方向延伸,形成新的DNA片段,該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板,如此重復(fù)改變溫度,由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個(gè)周期,反復(fù)循環(huán),使目的基因得以迅速擴(kuò)增。因此PCR循環(huán)過程為三部分構(gòu)成:模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DNA鏈延伸合成。 
(1)模板DNA的變性 
模板DNA加熱到90~95℃時(shí),雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂,雙鏈解開成為單鏈,稱為DNA的變性。變性溫度與DNA中G-C含量有關(guān),G-C間由三個(gè)氫鍵連接,而A-T間只有兩個(gè)氫鍵相連,所以G-C含量較高的模板,其解鏈溫度相對要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時(shí)間與模板DNA的二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。對于高G-C含量的模板DNA在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞砜(DMSO),并且在PCR循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97℃,時(shí)間適當(dāng)延長,即所謂的熱啟動。 
(2)模板DNA與引物的退火 
將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65℃時(shí),寡核苷酸引物與單鏈模板雜交,形成DNA模板-引物復(fù)合物。退火所需要的溫度和時(shí)間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度,并由于引物的長度顯著短于模板的長度,因此在退火時(shí),引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多,退火時(shí)間一般為1~2min。 
(3)引物的延伸 
DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。延伸所需要的時(shí)間取決于模板DNA的長度。在72℃條件下,Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40~60個(gè)堿基/秒。經(jīng)過一輪“變性-退火-延伸"循環(huán),模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中,新合成的DNA都可以起模板作用,因此每一輪循環(huán)以后,DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4min,一次PCR經(jīng)過30~40次循環(huán),約2~3h。擴(kuò)增初期,擴(kuò)增的量呈直線上升,但是當(dāng)引物、模板、聚合酶達(dá)到一定比值時(shí),酶的催化反應(yīng)趨于飽和,便出現(xiàn)所謂的“平臺效應(yīng)",即靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加。 
5.1.2 PCR反應(yīng)的五個(gè)元素 
參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為五種:引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+ 。

5.1.2.1 引物 
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 
引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下原則: 
(1)引物長度 
長度要求在15~30bp,常用為20bp左右,引物過短時(shí)會造成Tm值過低,在酶反應(yīng)溫度時(shí)不能與模板很好的配對;引物過長時(shí)又會造成Tm值過高,超過酶反應(yīng)的zui適溫度,且合成長引物還會使費(fèi)用大大增加。 
(2)引物堿基構(gòu)成 
引物的G+C含量以40~60%為宜,因?yàn)镚+C含量過高或過低都會直接造成Tm值的過高或過低,都不利PCR反應(yīng)的進(jìn)行。ATGC隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 
(3)引物二級結(jié)構(gòu) 
應(yīng)盡量避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),并且兩條引物間不能形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu),特別是3’端的互補(bǔ),否則形成引物二聚體,PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生非特異的條帶。引物自身也應(yīng)無回文對稱結(jié)構(gòu)(限制性酶切位點(diǎn)除外),防止形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

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