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抗體
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菌株
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細胞分離試劑
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堿裂解法大量提取質(zhì)粒DNA(同時純化)

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準備工作: 
細菌培養(yǎng):小量提取質(zhì)粒dna鑒定正確后,將菌液以1/50~1/20體積的比例接種到250ml液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長晚期。 
注:培養(yǎng)體積與zui終質(zhì)粒DNA的收獲量并無線性關(guān)系。只要培養(yǎng)條件適宜,50ml的培養(yǎng)液有時也可得到總量高達1mg以上的質(zhì)粒。 

操作步驟: 
1、細菌的收獲:將菌液倒入合適的離心管中,8000g離心5分鐘,棄上清,并在吸水紙上倒置離心管使上清全部流盡。 

2、將細菌沉淀重懸于10ml溶液I中。 
溶液I:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris•Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0) 
注:(1)若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制時間過久,可加入少量;(2)由于沉淀的影響,懸液的體積會達到11~13ml。

3、加15ml溶液Ⅱ,顛倒混勻。 
溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH,1%SDS 

4、加12ml溶液Ⅲ,輕微振蕩混勻。 
溶液Ⅲ:5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml 

5、12000g離心5分種,棄沉淀。將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 

6、加入60%體積的異丙醇,顛倒混勻后,室溫靜置5分鐘。12000g離心5分鐘,棄上清。

7、沉淀溶解于4~6mlTE中,加入1/50體積RNaseA貯存液,顛倒混勻,37℃靜置10分鐘。 

8、加入1/2體積的Tris飽和酚、1/2體積的氯仿-異戊醇(24:1)混合液,劇烈振蕩混勻。

9、4℃12000g離心30秒,將上層液體與少量下層液體轉(zhuǎn)移到另一離心管后,再12000g離心5分種,小心吸取上層液體。 

10、加入等體積13%聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/LNaCl混合液,顛倒混勻,冰上靜置0.5~2小時。 

11、4℃12000g離心10分種,棄上清,DNA沉淀用70%乙醇洗滌。 

12、沉淀干燥后,溶解于適量高壓滅菌的水中。 
注:(1)溶解體積一般為0.2~1ml;(2)此時得到的是已經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA,可直接進行各種酶學操作。 

13、取樣品進行電泳或紫外定量。 

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