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上海哈靈生物科技有限公司
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重組人乙酰膽堿酯酶治療有機(jī)磷效果研究
2013-11-27 閱讀(728)
對(duì)重組人乙酰膽堿酯酶其分子特性和生物學(xué)特性進(jìn)行篩選。
為進(jìn)一步rhAChE的體內(nèi)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ),從而為有機(jī)磷中毒開辟新的治療途徑。 根據(jù)疼痛基因庫的基因序列，用引物primier5軟件和合成正常流產(chǎn)哈赫基因特異性擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，胎兒大腦總RNA提取的RNA為模板，,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出hAChE ,將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體pUCm-T連接,構(gòu)建克隆表達(dá)載體,將其命名為pUCm-T/AChE,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),白色菌落篩選，質(zhì)粒DNA小量提取，測(cè)定并分析了消化和雙酶序列的PCR鑒定。
用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切克隆載體pUCm-T/AChE,回收AChE基因片段,并與經(jīng)同樣酶切的pET-28a（+）表達(dá)載體連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒,將其命名為pET-AChE,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中,通過Kan+篩選陽性質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定,將BL21（pET-AChE）工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),將誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的工程菌全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。根據(jù)改良埃爾曼法（比色法）人血乙酰膽堿酯酶和rHAChE活性檢測(cè)，比較。
重組人乙酰膽堿酯酶治療有機(jī)磷研究結(jié)果。
采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量的總RNA提取，OD260／od2801.8，OD260／od2701.2，表明游離酚殘留蛋白。取lulRNA樣品做甲醛變性凝膠電泳可見28S和18SRNA兩條帶,說明RNA基本完整。克隆的hAChE編碼序列為1845bp,與GenBank DNA數(shù)據(jù)庫中人乙酰膽堿酯酶基因序列一致。構(gòu)建了克隆表達(dá)載體pUCm-T/AChE和重組表達(dá)載體pET-AChE。SDS-PAGE電泳和Western blot分析表明，分子量約為68.2kda rHAChE，0.75mg/ml的濃度。
