細胞 GSK3α激酶活性光譜法定量檢測試劑盒產品說明書

主要用途

細胞 GSK3α激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在 GSK3β抑制劑的存在下，受到GSK3α磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統，測定產生 ADP 過程中，伴隨的還原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中 GSK3α特異活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣品中 GSK3α激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術背景

糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3；GSK3；EC 2.7.11.26）屬于激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其目標蛋白為糖原合成酶和活化T細胞核因子（nuclear factor of activated Tlymphocytes；NFAT），進行磷酸化后，抑制其功能，同時調控細胞對DNA損傷的反應、生物發(fā)育的組織排列（tissue patterning）、蛋白合成、細胞分化和繁殖等。糖原合成酶激酶3從酵母到人體高度進化保留，果蠅中GSK3同源蛋白為Shaggy（Zeste White 3），在Wnt信號通路中磷酸化β-catenin，導致后者泛素化后降解，防止β-catenin進入細胞核激活轉錄因子。糖原合成酶激酶3本身受到胰島素、生長因子、蛋白激酶B（proteinkinase B）/v-akt鼠源胸腺瘤病毒腫瘤基因同源體（akt）調控。糖原合成酶激酶3分成兩種異構體：糖原合成酶激酶3α和β，其結構相似，功能不同。糖原合成酶激酶3α有一段較長且富含（Glycine-rich）的N端。糖原合成酶激酶3α與β-類淀粉物-40/42多肽（beta-amyloid-40/ 42 peptides）大量產生有關。其功能異常將導致阿茲罕默綜合征等疾病。其磷酸化目標序列為RRAAEELDSRAGSPQL。基于底物RRAAEELDSRAGSPQL，在ATP和GSK3β抑制劑噻二唑烷酮-8（thiadiazolidinone-8；TDZD-8）的存在下，受到GSK3α激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析糖原合成酶激酶3α的特異活性。其反應方式為： 產品內容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

酶促液（Reagent D） 微升

反應液（Reagent E） 微升

底物液（Reagent F） 微升

陰性液（Reagent G） 微升

產品說明書 1 份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

GSK3α激酶：用于抑制劑篩選

1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于組織預處理

比色皿或酶標板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光譜分析

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 準備好 25cm2細胞培養(yǎng)瓶或 60mm 細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1 至 5 X 106細胞）

2． 小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用消化）

5． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10．轉移到預冷的 1.5 毫升離心管

11．強力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預冷的 1.5 毫升離心管

15．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里

2． 設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 1 分鐘，讀數 6 次（共 5 分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反應液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 5 分鐘

四、 樣品測定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反應液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 5 微升待測樣品（注意：50 微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 5 分鐘

五、 計算樣品活性

六、 酶標板測定

1． 在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中

3． 分別加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入 xx 微升反應液（Reagent E）

5． 分別加入 xx 微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動 96 孔酶標板

7． 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘

8． 分別加入 xx 微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50 微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動酶標板

10．即刻放進酶標儀檢測：0 分鐘讀數和 5 分鐘讀數

11．活性計算：

七、抑制劑篩選

1． 在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景、活性和待測抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑，進行樣品預處理

內容物 空背景對照 樣本背景 酶活性 待測抑制劑酶活性緩沖液（ReagentC）xx 微升 xx 微升 xx 微升 xx 微升陰性液（ReagentG）

xx 微升 xx 微升 xx 微升 ——

待測抑制劑 —— xx 微升 ―― xx 微升

用戶自備的純化酶 —— —— xx 微升（1 毫單位） xx 微升（1 毫單位）

96 孔板每孔總量 空背景對照孔

（xx 微升）

樣本背景孔

（xx 微升）

活性孔

（xx 微升）

待測抑制劑樣品孔

（xx 微升）

輕輕搖動酶標板，混勻，放進 30℃培養(yǎng)箱里孵育 30 分鐘。然后進行下列操作

3． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的 96 孔板的所有孔里

4． 分別加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

5． 分別加入 xx 微升反應液（Reagent E）

6． 分別加入 xx 微升底物液（Reagent F）

7． 輕輕搖動酶標板

8． 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘

9． 加入 20 微升上述預處理的待測樣品

10．即刻放進 30℃酶標儀檢測：測讀 30 分鐘

11．抑制活性計算： 注意事項

1． 本產品為 20 次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需 1 次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關重要

6． 加入樣品啟動反應后 3 秒內即刻光譜測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù) 30 分鐘

8． 光譜測定后，比色皿須清洗

9． 樣本測定 0 分鐘讀數高于 5 分鐘讀數表明具有酶活性

10．建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

12．可以使用 GSK3α抑制劑 Aloisine A 作為抑制劑對照或陰性對照

13．糖原合成酶激酶 3α活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5 條件下，每分鐘內能夠氧化 1 微摩爾還原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

14．本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產品經鑒定檢測敏感