細(xì)胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

細(xì)胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)熒光探針NMA供體和DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物，在γ分泌酶的水解作用下，釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA，而發(fā)生熒光峰值的變化，即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中γ分泌酶活性的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

技術(shù)背景

γ分泌酶（γ-SECRETASE；EC3.4.24.81），是一種多亞體蛋白酶復(fù)合物（multisubunit protease complex），由4種蛋白組成：早老素蛋白（Presenilin；PS）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective 1；APH1）和早老素增強(qiáng)蛋白2（presenilin enhancer 2）。其為整合性跨膜蛋白，在早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里組裝和成熟，后期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行目標(biāo)蛋白切離。γ分泌酶切離由β分泌酶切離淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein；APP）產(chǎn)生C99和α分泌酶切離的C83片段，前者成為具有神經(jīng)毒性的40至42氨基酸長(zhǎng)的淀粉樣β-多肽（amyloid-β peptide；Aβ）， 是阿茨罕默疾病（alzheimer disease；AD）的病理變化（淀粉樣斑；amyloid plaque）的主要成分，由此γ分泌酶成為阿茨罕默疾病治療的抗淀粉樣多肽藥物靶標(biāo)。γ分泌酶與NOTCH調(diào)節(jié)有關(guān)。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val（源于淀粉樣淀粉樣β-多肽前體蛋白序列708-715），通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長(zhǎng)的供體（donor）到覆蓋供體波長(zhǎng)的受體（acceptor），使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅（quench），使用2個(gè)熒光探針N-甲基氨茴酰NMA（N-Methyl-anthraniloyl）供體和二硝基苯基DNP（2,4-Dinitrophenyl）受體作為FRET對(duì)，來(lái)標(biāo)記的γ分泌酶選擇性多肽底物的兩端，在γ分泌酶的水解作用下，在丙氨酰（alaninyl）和蘇氨酰（threoninyl）殘基處切離，釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA，在熒光分光光度儀下（激發(fā)波長(zhǎng)340-360nm，散發(fā)波長(zhǎng)440-450nm），來(lái)定量測(cè)定γ分泌酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

底物液（Reagent D） 微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）      微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

γ分泌酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

黑色酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)355nm，散發(fā)波長(zhǎng)440nm，間隔10分鐘，讀數(shù)7次（共60分鐘） 
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1號(hào)管
• 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到2至5號(hào)管
• 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

三、熒光測(cè)定

（一）活性測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
• 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20微克純化酶或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 活性計(jì)算：

（二）活性抑制測(cè)定（抑制劑篩選）

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、零抑制、*抑制和待測(cè)抑制劑樣品
• 按下表加入試劑

• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 抑制活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 建議使用膜蛋白樣品為佳（推薦使用細(xì)胞可溶性膜蛋白（粗提）制備試劑盒
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
• 熒光濾波器可以使用激發(fā)波長(zhǎng)在340-360nm，散發(fā)波長(zhǎng)440-450nm
• 待測(cè)樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為20微克/20微升；膜蛋白樣品，為50微克/20微升；細(xì)胞裂解懸液，為100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）越高，表明酶活性越高
• 用戶可以使用γ分泌酶抑制劑L685,458（IC50=17納摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• γ分泌酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 6.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解釋放1納摩爾熒光產(chǎn)物NMA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列蛋白酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感