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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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細(xì)胞γ分泌酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法定量檢測(cè)試劑盒

時(shí)間:2017/1/17閱讀:1449
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細(xì)胞γ分泌酶γ-SECRETASE)活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

 

主要用途

 

細(xì)胞γ分泌酶γ-SECRETASE活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)熒光探針NMA供體和DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物,在γ分泌酶的水解作用下,釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA,而發(fā)生熒光峰值的變化即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)、部分或*純化酶樣品中γ分泌酶活性的定量檢測(cè),以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,安全可靠。

 

技術(shù)背景

 

γ分泌酶(γ-SECRETASE;EC3.4.24.81),是一種多亞體蛋白酶復(fù)合物(multisubunit protease complex),由4種蛋白組成:早老素蛋白(Presenilin;PS)、呆蛋白nicastrin)、前咽缺陷蛋白-1anterior pharynx defective 1;APH1)和早老素增強(qiáng)蛋白2presenilin enhancer 2。為整合性跨膜蛋白,在早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里組裝和成熟,后期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行目標(biāo)蛋白切離。γ分泌酶切離由β分泌酶切離淀粉樣前體蛋白amyloid precursor protein;APP)產(chǎn)生C99和α分泌酶切離的C83片段,前者成為具有神經(jīng)毒性的40至42氨基酸長(zhǎng)的淀粉樣β-多肽(amyloid-β peptide;Aβ), 是阿茨罕默疾病(alzheimer disease;AD)的病理變化(淀粉樣斑;amyloid plaque)的主要成分,由此γ分泌酶成為阿茨罕默疾病治療的抗淀粉樣多肽藥物靶標(biāo)。γ分泌酶與NOTCH調(diào)節(jié)有關(guān)。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val源于淀粉樣淀粉樣β-多肽前體蛋白序列708-715),通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Fluorescence resonance energy transfer;FRET),即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長(zhǎng)的供體(donor)到覆蓋供體波長(zhǎng)的受體(acceptor),使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅(quench),使用2個(gè)熒光探針N-甲基氨茴酰NMA(N-Methyl-anthraniloyl)供體和二硝基苯基DNP2,4-Dinitrophenyl受體作為FRET對(duì),來(lái)標(biāo)記的γ分泌酶選擇性多肽底物的兩端,在γ分泌酶的水解作用下,在丙氨酰(alaninyl)和蘇氨酰(threoninyl)殘基處切離,釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA,在熒光分光光度儀下(激發(fā)波長(zhǎng)340-360nm,散發(fā)波長(zhǎng)440-450nm),來(lái)定量測(cè)定γ分泌酶的活性。反應(yīng)系統(tǒng)為:

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A) 毫升

裂解液(Reagent B) 毫升

緩沖液(Reagent C) 毫升

底物液(Reagent D) 微升

標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E)      微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份

 

 

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A4冰箱里,其余的保存在-20冰箱里;底物液(Reagent D)和標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E避免光照,有效保證6

 

用戶自備

 

γ分泌酶:用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管:用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒:用于貼壁細(xì)胞脫離

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于細(xì)胞預(yù)處理

黑色酶標(biāo)板:用于反應(yīng)和比色的容器

熒光酶標(biāo)儀:用于熒光分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

一、樣品準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(15 X 106細(xì)胞)
  • 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋生長(zhǎng)表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:避免使用胰酶消化
  • 加入xx毫升清理液(Reagent A,混勻細(xì)胞
  • 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始
  • 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混勻
  • 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 強(qiáng)力渦旋震蕩15
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒
  • 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

  • 測(cè)定準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等),置于冰槽里
  • 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀(溫度為37℃):激發(fā)波長(zhǎng)355nm,散發(fā)波長(zhǎng)440nm,間隔10分鐘,讀數(shù)7次(共60分鐘) 
  • 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管,標(biāo)記為15號(hào)管
  • 加入xx微升緩沖液(Reagent C1號(hào)管
  • 分別加入xx微升緩沖液(Reagent C25號(hào)管
  • 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E1號(hào)管,混勻
  • 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E2號(hào)管,混勻
  • 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E3號(hào)管,混勻
  • 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E4號(hào)管,混勻
  • 15號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

 

管號(hào)

緩沖液(Reagent C

標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E

標(biāo)準(zhǔn)NMA濃度

1

xx微升

xx微升

xx微摩爾/升

2

xx微升

xx微升1號(hào)管

xx微摩爾/升

3

xx微升

xx微升2號(hào)管

xx微摩爾/升

4

xx微升

xx微升3號(hào)管

xx微摩爾/升

5

xx微升

0

0

 

三、熒光測(cè)定

 

(一)活性測(cè)定

  • 96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品
  • 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C到相應(yīng)孔中
  • 分別加入xx微升底物液(Reagent D
  • 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品(20微克純化酶或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)(注意:樣品須清澈
  • 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
  • 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè):獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU(Relative Fluorescence Unit
  • 活性計(jì)算:

(二)活性抑制測(cè)定(抑制劑篩選)

  • 96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景、零抑制、*抑制和待測(cè)抑制劑樣品
  • 按下表加入試劑

內(nèi)容物

樣本背景

零抑制對(duì)照

0%抑制)

*抑制對(duì)照

100%抑制)

待測(cè)抑制活性

緩沖液(Reagent C

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

底物液(Reagent D

――

xx微升

xx微升

xx微升

待測(cè)抑制劑

xx微升

――

――

xx微升

用戶自備的純化酶

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

96孔板每孔總量

背景孔

xx微升)

零抑制孔

xx微升)

*抑制孔

xx微升)

待測(cè)抑制劑樣品

xx微升)

 

  • 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
  • 37℃溫度下孵育60分鐘
  • 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè):獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU(Relative Fluorescence Unit
  • 抑制活性計(jì)算:

 

  

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為25次操作,包括標(biāo)準(zhǔn)液
  • 建議使用膜蛋白樣品為佳(推薦使用細(xì)胞可溶性膜蛋白(粗提)制備試劑盒
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 系統(tǒng)操作過(guò)程中,標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次
  • 樣品須澄清,至關(guān)重要
  • 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
  • 熒光濾波器可以使用激發(fā)波長(zhǎng)在340-360nm,散發(fā)波長(zhǎng)440-450nm
  • 待測(cè)樣本為粗提酶樣品,其蛋白濃度為20微克/20微升;膜蛋白樣品,為50微克/20微升;細(xì)胞裂解懸液,為100微克/20微升(本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒)
  • 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 相對(duì)熒光讀數(shù)RFU(Relative Fluorescence Unit)越高,表明酶活性越
  • 用戶可以使用γ分泌酶抑制劑L685,458(IC50=17納摩爾)作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
  • γ分泌酶活性單位濃度定義:在37溫度下,pH 6.8條件下,每分鐘內(nèi)能夠水解釋放1摩爾熒光產(chǎn)物NMA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
  • 本公司提供系列蛋白酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

 

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