細胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針NMA供體和DNP受體雙重標記的多肽底物，在γ分泌酶的水解作用下，釋放出強烈熒光的NMA，而發(fā)生熒光峰值的變化，即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中γ分泌酶活性的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

技術(shù)背景

γ分泌酶（γ-SECRETASE；EC3.4.24.81），是一種多亞體蛋白酶復合物（multisubunit protease complex），由4種蛋白組成：早老素蛋白（Presenilin；PS）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective 1；APH1）和早老素增強蛋白2（presenilin enhancer 2）。其為整合性跨膜蛋白，在早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里組裝和成熟，后期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行目標蛋白切離。γ分泌酶切離由β分泌酶切離淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein；APP）產(chǎn)生C99和α分泌酶切離的C83片段，前者成為具有神經(jīng)毒性的40至42氨基酸長的淀粉樣β-多肽（amyloid-β peptide；Aβ）， 是阿茨罕默疾?。╝lzheimer disease；AD）的病理變化（淀粉樣斑；amyloid plaque）的主要成分，由此γ分泌酶成為阿茨罕默疾病治療的抗淀粉樣多肽藥物靶標。γ分泌酶與NOTCH調(diào)節(jié)有關(guān)。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val（源于淀粉樣淀粉樣β-多肽前體蛋白序列708-715），通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長的供體（donor）到覆蓋供體波長的受體（acceptor），使得距離依賴性反應的供體的散發(fā)光子淬滅（quench），使用2個熒光探針N-甲基氨茴酰NMA（N-Methyl-anthraniloyl）供體和二硝基苯基DNP（2,4-Dinitrophenyl）受體作為FRET對，來標記的γ分泌酶選擇性多肽底物的兩端，在γ分泌酶的水解作用下，在丙氨酰（alaninyl）和蘇氨酰（threoninyl）殘基處切離，釋放出強烈熒光的NMA，在熒光分光光度儀下（激發(fā)波長340-360nm，散發(fā)波長440-450nm），來定量測定γ分泌酶的活性。其反應系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

底物液（Reagent D） 微升

標準液（Reagent E）      微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

γ分泌酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于標準樣品操作和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

黑色酶標板：用于反應和比色的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光酶標儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長355nm，散發(fā)波長440nm，間隔10分鐘，讀數(shù)7次（共60分鐘） 
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1號管
• 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取xx微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

三、熒光測定

（一）活性測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應孔中
• 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
• 分別加入20微升上述配制的標準液或待測樣品（20微克純化酶或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 活性計算：

（二）活性抑制測定（抑制劑篩選）

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景、零抑制、*抑制和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑

• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 抑制活性計算：

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標準液
• 建議使用膜蛋白樣品為佳（推薦使用細胞可溶性膜蛋白（粗提）制備試劑盒
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，標準液測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 熒光濾波器可以使用激發(fā)波長在340-360nm，散發(fā)波長440-450nm
• 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為20微克/20微升；膜蛋白樣品，為50微克/20微升；細胞裂解懸液，為100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）越高，表明酶活性越高
• 用戶可以使用γ分泌酶抑制劑L685,458（IC50=17納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• γ分泌酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 6.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解釋放1納摩爾熒光產(chǎn)物NMA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感