您好, 歡迎來(lái)到環(huán)保在線! 登錄| 免費(fèi)注冊(cè)| 產(chǎn)品展廳| 收藏商鋪|
18918128223
細(xì)胞γ分泌酶(γ-SECRETASE)活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
細(xì)胞γ分泌酶(γ-SECRETASE)活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)熒光探針NMA供體和DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物,在γ分泌酶的水解作用下,釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA,而發(fā)生熒光峰值的變化,即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體)、部分或*純化酶樣品中γ分泌酶活性的定量檢測(cè),以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,安全可靠。
技術(shù)背景
γ分泌酶(γ-SECRETASE;EC3.4.24.81),是一種多亞體蛋白酶復(fù)合物(multisubunit protease complex),由4種蛋白組成:早老素蛋白(Presenilin;PS)、呆蛋白(nicastrin)、前咽缺陷蛋白-1(anterior pharynx defective 1;APH1)和早老素增強(qiáng)蛋白2(presenilin enhancer 2)。其為整合性跨膜蛋白,在早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里組裝和成熟,后期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行目標(biāo)蛋白切離。γ分泌酶切離由β分泌酶切離淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein;APP)產(chǎn)生C99和α分泌酶切離的C83片段,前者成為具有神經(jīng)毒性的40至42氨基酸長(zhǎng)的淀粉樣β-多肽(amyloid-β peptide;Aβ), 是阿茨罕默疾病(alzheimer disease;AD)的病理變化(淀粉樣斑;amyloid plaque)的主要成分,由此γ分泌酶成為阿茨罕默疾病治療的抗淀粉樣多肽藥物靶標(biāo)。γ分泌酶與NOTCH調(diào)節(jié)有關(guān)。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val(源于淀粉樣淀粉樣β-多肽前體蛋白序列708-715),通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Fluorescence resonance energy transfer;FRET),即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長(zhǎng)的供體(donor)到覆蓋供體波長(zhǎng)的受體(acceptor),使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅(quench),使用2個(gè)熒光探針N-甲基氨茴酰NMA(N-Methyl-anthraniloyl)供體和二硝基苯基DNP(2,4-Dinitrophenyl)受體作為FRET對(duì),來(lái)標(biāo)記的γ分泌酶選擇性多肽底物的兩端,在γ分泌酶的水解作用下,在丙氨酰(alaninyl)和蘇氨酰(threoninyl)殘基處切離,釋放出強(qiáng)烈熒光的NMA,在熒光分光光度儀下(激發(fā)波長(zhǎng)340-360nm,散發(fā)波長(zhǎng)440-450nm),來(lái)定量測(cè)定γ分泌酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為:
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
緩沖液(Reagent C) 毫升
底物液(Reagent D) 微升
標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E) 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里;底物液(Reagent D)和標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E)避免光照,有效保證6月
用戶自備
γ分泌酶:用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管:用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作和樣品保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器
細(xì)胞刮脫棒:用于貼壁細(xì)胞脫離
(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于細(xì)胞預(yù)處理
黑色酶標(biāo)板:用于反應(yīng)和比色的容器
熒光酶標(biāo)儀:用于熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
一、樣品準(zhǔn)備
管號(hào) | 緩沖液(Reagent C) | 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E) | 標(biāo)準(zhǔn)NMA濃度 |
1 | xx微升 | xx微升 | xx微摩爾/升 |
2 | xx微升 | xx微升1號(hào)管 | xx微摩爾/升 |
3 | xx微升 | xx微升2號(hào)管 | xx微摩爾/升 |
4 | xx微升 | xx微升3號(hào)管 | xx微摩爾/升 |
5 | xx微升 | 0 | 0 |
三、熒光測(cè)定
(一)活性測(cè)定
(二)活性抑制測(cè)定(抑制劑篩選)
內(nèi)容物 | 樣本背景 | 零抑制對(duì)照 (0%抑制) | *抑制對(duì)照 (100%抑制) | 待測(cè)抑制活性 |
緩沖液(Reagent C) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
底物液(Reagent D) | ―― | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
待測(cè)抑制劑 | xx微升 | ―― | ―― | xx微升 |
用戶自備的純化酶 | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
96孔板每孔總量 | 背景孔 (xx微升) | 零抑制孔 (xx微升) | *抑制孔 (xx微升) | 待測(cè)抑制劑樣品 (xx微升) |
注意事項(xiàng)
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
請(qǐng)輸入賬號(hào)
請(qǐng)輸入密碼
請(qǐng)輸驗(yàn)證碼
以上信息由企業(yè)自行提供,信息內(nèi)容的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和合法性由相關(guān)企業(yè)負(fù)責(zé),環(huán)保在線對(duì)此不承擔(dān)任何保證責(zé)任。
溫馨提示:為規(guī)避購(gòu)買風(fēng)險(xiǎn),建議您在購(gòu)買產(chǎn)品前務(wù)必確認(rèn)供應(yīng)商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量。